Формирование и функционирование кинетохора
Центромерные последовательности не являются необходимыми или достаточными для формирования и функционирования кинетохора.
Большая величина и сложность центромерных последовательностей у многоклеточных эукариот сделали затруднительным анализ потребностей в нуклеотидной последовательности ДНК с помощью определенных конструктов, столь успешно использовавшихся в исследованиях на дрожжах. Тем не менее, путем трансфекции клеток культуры ткани набором сателлитных ДНК были созданы с низкой частотой искусственные хромосомы человека ( HACs ), но они обнаружили высокий уровень митотической нестабильности ( Rudd et al., 2003 ). Мы знаем, однако, что HACs образованы путем конкатемеризации введенных наборов сателлитов, и тем не менее некоторые альфа-сателлитные наборы не могут формировать центромеры de novo, что заставляет предположить потребность в множественных, неизвестных этапах или факторах. Более недавние исследования показали, что уникальные свойства и компоненты центромерного хроматина (как объясняется в разделе " Необычный состав центромерного хроматина " далее в этой главе) имеются в HACs как в сателлитных наборах, так и в нецентромерных последовательностях (например, последовательностях плазмидного вектора и селектируемого маркера) ( Lam et al., 2006 ). Таким образом, остается все еще неясным, насколько специфические последовательности ДНК достаточны для сборки и поддержания функциональных центромер человека.
Первое указание на то, что идентичность и воспроизведение центромер регулируются эпигенетически, было получено в исследованиях "минимальных" центромерных конструктций у S. pombe ( Steiner and Clarke, 1994 ). Небольшая доля трансформантов, полученных с помощью конструктов, обнаруживала переключение с редуцированной центромерной функции к высоко "активному" центромерному функционированию (0,6% клеток), что впоследствии могло воспроизводиться в линии на протяжении многих поколений. Таким образом, одни и те же нуклеотидные последовательности ДНК могут демонстрировать два функционально различных, наследуемых состояния, аналогично наблюдениям эпигенетических влияний на генную экспрессию при PEV (глава " DROSOPHILA: ЭФФЕКТ ПОЛОЖЕНИЯ, ГЕТЕРОХРОМАТИН И САЙЛЕНСИНГ ГЕНОВ ") или ТРЕ (глава " ЭПИГЕНЕТИКА ДРОЖЖЕЙ S. CEREVISIAE ").
Другие наблюдения заставляют предполагать главную роль эпигенетических механизмов в детерминации идентичности центромер и формировании кинетохоров у многоклеточных эукариот. Во-первых, нуклеотидные последовательности ДНК, в норме ассоциированные с центромерами, не достаточны для функционирования. Например, только подгруппа гетерохроматиновых сателлитных последовательностей мыши и человека связана с центромерной функцией ( Lam et al., 2006 ). Кроме того, в функциональных хромосомах с двумя участками центромерных сателлитов (дицентрики), наблюдаемых у мух и у человека, один из этих участков теряет способность формировать кинетохор ( Sullivan and Willard, 1998 ). Во-вторых, центромерные последовательности не являются необходимыми для формирования кинетохора, поскольку нецентромерная ДНК может приобретать и надежно воспроизводить центромерную функцию благодаря процессу, известному как " формирование неоцентромеры " ( рис. 14.5 а). У человека были идентифицированы многочисленные функциональные неоцентромеры, и анализ нуклеотидной последовательности показал, что эти новые районы формирования кинетохоров не приобрели сателлитных ДНК. Однако участки, фланкирующие новый кинетохор, приобрели эпигенетические свойства, сравнимые с соответствующими районами в эндогенных центромерах (т.е. перицентрическом хроматине), такими как метилирование H3K9 и связывание HP1 ( Lo et al., 2001 ).
Хотя механизм формирования неоцентромер у человека не известен, в модельной системе неоцентромеры были созданы экспериментально. У Drosophila неоцентромеры получаются из минихромосом, когда помещаются рядом нецентромерная ДНК и эндогенная центромера ( рис. 14.5 б) ( Maggert and Karpen, 2001 ). Таким образом, у Drosophila для активации неоцентромеры требуется близость к функциональной центромере, заставляя предполагать, что одним из механизмов приобретения центромеры является распространение центромерных белков в cis-конфигурации на соседние, нецентромерные участки. Коль скоро это распространение произошло, центромерная функция затем воспроизводится в этом новом сайте эпигенетически. Интересно, что формирование неоцентромеры подавляется, когда между эндогенной центромерой и участком формирования неоцентромеры присутствует гетерохроматин, заставляя предполагать, что в определении величины центромеры играют роль дополнительные эпигенетические механизмы.
Наконец, признаком эволюции являются хромосомные перестройки. Эти изменения сопровождаются приобретением, утратой и перемещениями центромер по отношению к нуклеотидным последовательностям генома ( Ferreri et al., 2005 ). Такую пластичность легче всего объяснить, если идентичность центромеры определяется эпигенетически, как это описано далее в разделе " Эпигенетика и эволюция центромер ".
