Репликативная вилка эукариот
Репликационная вилка имеет Y-образную асимметричную структуру, так как способ синтеза ДНК на "ведущей" и "отстающей" цепях различен. У бактерий геном столь мал, что вся ДНК может полностью реплицироваться с помощью всего лишь двух репликационных вилок. В хромосомах млекопитающих цепи ДНК в 50 раз длиннее, поэтому для ее полной репликации за разумное время нужно, чтобы одновременно действовало много репликационных вилок. В среднем в каждой S фазе в каждой хромосоме функционирует около 100 вилок. Механизмы репликации ДНК у высших эукариот изучены менее чем у прокариот из-за их большей сложности. Основные результаты получены на модельной системе с ДНК вируса SV40 , в которой процесс репликации исследовали в зараженных клетках человека, культивируемых in vitro. В этой системе вирусный белок, называемый Т-антигеном , выполняет многие функции, необходимые для репликации вирусной ДНК. Во-первых, он является белком-инициатором, необходимым для инициации репликации; во-вторых, он обладает ДНК-хеликазной активностью, т.е. расплетает цепи реплицируемой ДНК перед работающей ДНК-полимеразой, и, в-третьих, Т-антиген необходим для правильного взаимодействия с ДНК ферментного комплекса, синтезирующего праймеры ( праймосомы ). Тем не менее, вирус SV40 использует для репликации ДНК своей небольшой хромосомы и многие белки клетки-хозяина, что позволяет исследовать функционирование репликативного комплекса клеток человека в такой относительно простой системе.
Метод, впервые использованный для того, чтобы выяснить, как реплицируются хромосомы эукариот, был разработан в начале 60-х годов. Клетки, растущие в культуре, инкубируют короткое время в присутствии Н3- тимидина с таким расчетом, чтобы ДНК, синтезированная за этот период, оказалпсь высокорадиактивной. Затем клетки осторожно лизируют и их ДНК наносят на поверхность стекла, по возможности растягивая ее молекулы. Стекло покрывают фотоэмульсией и синтез ДНК выявляют методом радиоавтографии. Поскольку время инкубации с меченым тимидином выбирают так, чтобы репликационная вилка успела продвинуться вдоль ДНК на несколько микромеиров, реплицированные участки ДНК видны под микроскопом как линии из зерен серебра, хотя сама ДНК остается невидимой. Результатом такого опыта являются радиоавтографы, на которых видны следы реплицированной ДНК, длина которых увеличивается с удлинением периода включения Н3-тимидина.
Такие опыты показывают, что в хромосомах эукариот репликационные вилки движутся со скоростью около 50 нуклеотидов в секунду. Это в 10 раз меньше, чем у бактерий, что, возможно, связано с большей трудностью репликации ДНК, упакованной в хроматин.
Каждая хромосома человека, по-видимому, состоит из одной молекулы ДНК, содержащей около 150 млн. нуклеотидов, поэтому для полной репликации такой молекулы с помощью одной репликационой вилки потребовалось бы 3 000 000 секунд, т.е. 800 часов! В действительности фаза S продолжается 8-10 часов. Не удивительно, что метод радиоавтографии выявил существование многих независимо продвигающихся репликационных вилок в каждой эукариотической хромосоме. Удивительно другое: часто бывает, что несколько вилок расположено поблизости друг от друга в одном участке ДНК, в то время как другие области той же хромосомы их вовсе не содержат. Изучая скорость перемещения репликационных вилок и их пространственное расположение можно определить направление их движения.
Такого рода опыты показали следующее:
1. Места образования репликационных вилок расположены группами, которые называют " репликативные единицы ". В каждую группу входит от 20 до 80 точек начала репликации . Внутри такой группы точки начала репликации отстоят друг от друга на 30 000 -300 000 пар оснований.
2. На протяжении всей фазы S активируются новые репликативные единицы, пока не будет реплицирована вся ДНК.
3. В большинстве случаев репликационные вилки расположены парами: две вилки одной пары движутся в противоположных направлениях от общей точки начала репликации, образуя структуру, называемую " репликационный пузырь " или "глаз".
4. В репликативных единицах репликационные вилки прекращают движение, когда встречают соседнюю вилку, движущуюся в противоположном направлении. Таким образом, ДНК в данной области хромосомы реплицируется, образуя две полные дочерние спирали.
5. На протяжении всей фазы S репликационные вилки продвигаются примерно с одинаковой скоростью.
