MutY, MUTYH (Аденин-ДНК-гликозилаза гетеродуплексов)
Репарация гетеродуплексов в E. coli по большей части проходит с участием белков MutS , MutH и MutL , не входящих в систему ЭРО, по механизму, зависящему от метилирования последовательностей GATC Dam метилазой [ Friedberg, ea 2006 ].
Однако в конце 1980-хгг. в клетках E.coli был обнаружен отдельный, независимый от статуса метилирования по сайтам GATC способ репарации неканонических пар G:A с превращением их в G:C [ Lu, ea 1988 ]. Независимо от этого у E.coli был открыт мутаторный локус mutY, инактивация которого приводила к возрастанию частоты трансверсий G:C-T:A [ Nghiem, ea 1988 ]. Позднее было показано, что продукт mutY гена представляет собой ДНК-гликозилазу, выщепляющую Ade из неканонических пар Ade:Gua и предотвращающую таким образом мутагенез, связанный с появлением в ДНК таких гетеродуплексов [ Lu, ea 1988 , Au, ea 1989 ].
Аналогичная MutY ферментативная активность была выделена из тканей крупного рогатого скота и клеток человека [ McGoldrick, ea 1995 ]. См. mutyh ген человека
От других ДНК-гликозилаз (за исключением TDG и MBD4) ферменты MutY/MUTYH отличаются тем, что выщепляют из ДНК немодифицированное основание, находящееся в составе неканонической пары. Помимо пар Ade:Gua, фермент с невысокой эффективностью выщепляет Ade из пар Ade:Cyt [340]. Сообщалось также о наличии у MutY активности, удаляющей Gua из пар с 8-oxoGua [ Zhang, ea 1998 ]. Анализ активности MutY по отношению к субстратам, содержащим различные модифицированные основания, показывает, что фермент достаточно специфичен по отношению к выщепляемому Ade, но может использовать субстраты, содержащие достаточно широкий спектр оснований напротив него [ Bulychev, ea 1996 ]. Одним из наилучших субстратов для MutY служит ДНК, содержащая пару Ade:8-oxoGua [ Porello, ea 1998 , Michaels, ea 1992 , Bulychev, ea 1996 ]; активность фермента по отношению к ней на 1-2 порядка превышает активность по отношению к субстратам Ade:Gua. По этой причине MutY функционально дополняет активности ферментов Fpg и MutT в единой системе предотвращения мутагенного действия 8-oxoGua (разд. GO система ). Субстратная специфичность эукариотических белков MUTYH сходна со специфичностью фермента MutY [ McGoldrick, ea 1995 ], однако они также способны эффективно выщеплять из ДНК основания 2-OH- Ade [ Ohtsubo, ea 2000 ].
Достаточно долгое время в литературе дискутировался вопрос о том, обладает ли MutY AP-лиазной активностью ; первоначально фермент был описан и как монофункциональная [ Au, ea 1989 ], и как бифункциональная ДНК-гликозилаза [ Lu, ea 1988 ]. Последнее вызывало сомнения, поскольку, как упоминалось выше, в последовательности MutY отсутствует остаток Lys120, необходимый для проявления AP-лиазной активности. Позднее было показано, что MutY представляет собой монофункциональную ДНК-гликозилазу, а некоторые косвенные признаки AP-лиазной активности (например, способность MutY пришиваться к субстратной ДНК под действием NaBH4) объясняются наличием в активном центре фермента остатка Lys142, не принимающего непосредственного участия в реакции нуклеофильного замещения [ Zharkov, ea 1998 ]. Введение в последовательность фермента остатка Lys120 превращает его в бифункциональную ДНК-гликозилазу.
Из всех ДНК-гликозилаз для MutY ингибирование продуктом проявляется наиболее сильно; в то время как выщепленное основание Ade диссоциирует из комплекса с ферментом за секунды [ McCann, ea 2003 ], время полураспада комплекса MutY с AP-продуктом реакции в случае субстрата Ade:8-oxoGua измеряется часами [ Zharkov, ea 1998 , Porello, ea 1998 ], и даже в случае субстрата Ade:Gua - минутами или десятками минут [ Porello, ea 1998 ].
AP-эндонуклеазы E.coli стимулируют активность Eco-MutY по отношению к субстратам Ade:Gua, но не к Ade:8-oxoGua [ Pope, ea 2002 ]. Для белка MUTYH из клеток млекопитающих показана стимуляция ферментом APEX1 и в случае субстратов Ade:8-oxoGua [ Pope, ea 2005 ]. MUTYH связывается с белками репликации PCNA и RPA [ Parker, ea 2001 ], что свидетельствует о возможном его участии в репарации непосредственно в репликативной вилке. Также сообщалось о взаимодействии белка MUTYH с гетеродимерным фактором системы репарации гетеродуплексов MSH2/MSH6 , стимулирующем связывание ДНК и ДНК-гликозилазную активность MUTYH [ Bai, ea 2005 ].
Поскольку подвижность рекомбинантного белка MUTYH отличается от его подвижности в лизате клеток млекопитающих, но это различие устраняется после обработки фосфатазой, выдвигалось предположение, что фермент в клетках фосфорилирован, и что это повышает его активность [ Parker, ea 2003 ].
Ограниченный протеолиз MutY приводит к отщеплению от него C- концевого NUDIX-подобного фрагмента [ Manuel, ea 1996 , Gogos, ea 1996 ]. Оставшийся N-концевой фрагмент с ММ ~25кДа (MutY-p25), гомологичный белку Nth , полностью сохраняет каталитическую активность [ Manuel, ea 1996 ], но его субстратная специфичность несколько изменяется: активность по отношению к Ade:8-oxoGua падает до уровня, одинакового с активностью по отношению к Ade:Gua, за счет снижения сродства к звену 8-oxoGua [ Noll, ea 1999 , Gogos, ea 1996 , Chmiel, ea 2001 ]. С другой стороны, MutY-p25 меньше ингибируется продуктом реакции, чем полноразмерный фермент [ Chmiel, ea 2001 ].
Система защиты ДНК от окисления
гуанинов у E. coli
