Nth пространственная структура
Структура Nth определена методом РСА для белка из E.coli (Eco-Nth) в свободном состоянии [ Thayer, ea 1995 ] и для белка из B.stearothermophilus в ковалентном комплексе с ДНК, стабилизированном NaBH4 [ Fromme, ea 2003 ]. Белок состоит из двух доменов. Структурную основу одного из них составляет "бочонок" из 6 a-спиралей ( 6HB-домен ). В нем расположены элементы, характерные для подавляющего большинства членов данного суперсемейства- мотив HhH и петля, содержащая большое количество остатков Gly, Pro и Val, а также абсолютно консервативный каталитический остаток Asp ( GPD (PVD) . Другой домен ( FeS-домен ) содержит 4 a-спирали и FeS-кластер.
В структуре комплекса Nth-ДНК молекула ДНК связывается в бороздке между 6HB- и FeS-доменами, при этом остатки мотива HhH участвуют в связывании. Мотив HhH был впервые описан в структуре Nth и обнаружен затем во многих ДНК-зависимых белках [ Thayer, ea 1995 , Doherty, ea 1996 ]. Он образован 2 a-спиралями, соединенными шпилькой, состоящей из поворота типа II. От распространенного среди ДНК-связывающих регуляторных белков мотива спираль - поворот - спираль ( HtH ) мотив HhH отличается структурой поворота и взаимной упаковкой спиралей, что приводит к невозможности непосредственной укладки одной из спиралей в большую бороздку ДНК, как это происходит с "узнающей" спиралью мотива HtH. Поэтому взаимодействие мотива HhH с ДНК не зависит от ее последовательности. Помимо ДНК-гликозилаз суперсемейства Nth, мотив HhH присутствует в белках, функции которых связаны с репарацией (ДНК-полимеразы I и IV прокариот и ДНК- полимераза-b эукариот, FEN1, UvrC, RuvA, XPG, ERCC1, RadC, RecR), репликацией (ДНК-полимераза III, RFC, NAD+-зависимая ДНК-лигаза прокариот) и другими процессами метаболизма ДНК (экзонуклеаза I, терминальная трансфераза, некоторые транспозазы) [ Doherty, ea 1996 ].
Мотив GPD менее консервативен, чем мотив HhH; единственный его абсолютно неизменный элемент - это остаток Asp (Asp138 в Eco-Nth). Этот мотив встречается, по-видимому, только в составе ДНК-гликозилаз. В остальном мотив отличается большим содержанием остатков, дезорганизующих a-спиральную структуру (Gly, Pro) и обеспечивающих сохранение этого участка полипептида в виде растянутой цепи, упакованной со второй спиралью мотива HhH.
Между доменами Nth располагается положительно заряженная бороздка, служащая для связывания ДНК. Введенное в кристалл основание Thy(OH)2 связывается в области петли Gly112-Arg119, однако в структуре на дне бороздки также обнаруживается тесная полость, которая потенциально может служить карманом для связывания поврежденного основания.
FeS-кластер, располагающийся в FeS-домене, отличается уникальной L- киральностью от D-киральных Fe4S4-кластеров во всех остальных содержащих их белках. Возможно, это служит причиной его меньшей активности в окислительно-восстановительных реакциях по сравнению с FeS-кластерами в других белках. Кластер располагается в гидрофобном ядре домена и закрыт для растворителя, также он не имеет прямого выхода в ДНК-связывающую бороздку. FeS-кластер необходим для поддержания корректной конформации других ДНК-связывающих элементов и не играет роли в катализе. В структуре комплекса также наблюдаются аминокислотные остатки, внедряющиеся в межцепочечную полость. Выщепленное поврежденное основание в активном центре в структуре ковалентного комплекса Nth-ДНК не обнаруживается.
Мотивы HhH и GPD присутствуют в очень многих ДНК-гликозилазах, и их можно считать определяющими для отнесения белка к суперсемейству Nth. Белки, принадлежащие к центральным семействам этого суперсемейства - Nth , MutY , MIG (и, по-видимому, Pdg2 ) - содержат 6HB- и FeS-домены и FeS-кластер. К этим центральным семействам примыкают AGOG и MagIII , у которых сохранен 6HB-домен, а FeS-домен в целом похож на имеющийся у белков центральных семейств, но не содержит FeS-кластера. В суперсемейство Nth входят также OGG1 , AlkA и MBD4 , у которых есть HhH- и GPD-мотивы, но структуры доменов уже довольно сильно отличаются от прототипических белков и появляются другие структурные элементы. Еще дальше от центральных семейств отстоят белки Tag , обладающий HhH- мотивом, но не GPD-мотивом, и DenV , у которого тоже нет GPD-мотива, а вторая спираль HhH-мотива заменена неспиральной последовательностью [ Huffman, ea 2005 ].
