Протоонкогены: механизмы активации, амплификация участков ДНК
Амплификация участков ДНК приводит к активации онкогенов за счет усиления их экспрессии. Увеличение числа копий фрагмента ДНК может сопровождаться появлением специфических хромосомных аберраций, которые выявляются цитогенетически как равномерно окрашиваемые участки обычных хромосом или как дополнительные пары маленьких хромосом, так называемые двойные микрохромосомы ( рис. 84.9 ). Предполагают, что амплификация ДНК определенного локуса в опухолевой клетке дает ей преимущество перед нормальными клетками, что проявляется в ускорении роста или повышении устойчивости к противоопухолевым средствам.
Выявление амплифицированных участков ДНК значительно облегчается благодаря методу двухцветной флюоресцентной гибридизации in situ, названному сравнительной геномной гибридизацией. Из опухолевой и нормальной тканей выделяют ДНК, метят разными флюоресцентными красителями и гибридизуют с нормальными метафазными хромосомами. Участки ДНК опухолевых клеток, содержащие дупликации и делеции, распознают по изменению интенсивности флюоресценции. Этот метод позволяет исследовать весь геном и выявить те хромосомные фрагменты, которые предположительно содержат гены, участвующие в развитии злокачественных новообразований.
Установлено, что в опухолевых клетках человека многие гены подвергаются амплификации. Некоторые протоонкогены (включая MYCN ) были идентифицированы благодаря их присутствию в амплифицированных участках ДНК опухолевых клеток, а также их гомологии с известными онкогенами. При некоторых типах злокачественных новообразований (особенно при саркомах ) амплифицированный участок длиной в сотни тысяч нуклеотидов может содержать более одного онкогена.
Амплификация участка ДНК на 12-й хромосоме выявлена при различных саркомах и нейробластоме у человека ( рис. 84.10 ).
Гены MDM2 , GLI , CDK4 , SAS , а также другие гены, контролирующие клеточную пролиферацию , нередко амплифицируются одновременно.
Для некоторых злокачественных новообразований прослежена связь клинических проявлений с амплификацией генов (особенно гена ERBB2 при раке молочной железы и MYCN npи нейробластоме ); амплификация клеточного протоонкогена, как правило, свидетельствует о неблагоприятном прогнозе. Амплификация гена может придавать опухолевым клеткам устойчивость к химиотерапии. Так, на фоне лечения метотрексатом , который угнетает активность дигидрофолатредуктазы , нередко появляются клетки с амплификацией гена, кодирующего этот фермент.
Существует много примеров амплификации различных протоонкогенов в клеточных линиях, выделенных из разнообразных типов опухолей: ген c-myc амплифицирован 20-30-кратно в линии лейкозных клеток ( Collins S., Groudine M., 1982 ) и в нейробластомах ( van Devanter D.R. et al., 1990 ); ген c-abl амплифицирован 10-кратно в клетках миелоидного лейкоза ( Collins S.J., Groudine M.T., 1983 ).
Солидные опухоли также имеют амплифицированные протоонгогены: c-erbB амплифицирован в 15-20 раз в клетках эпидермальной карциномы и c-myc амплифицирован в 30 раз в клетках карциномы прямой кишки ( Alitalo K. et al., 1983 ). Во многих из перечисленных выше случаев было показано, что амплифицированные гены кодируют вполне нормальный продукт.
Таким образом, онкогенная активация происходит в основном в результате гиперэкспрессии амплификацированного протоонкогена.
Изучение последовательностей в ДМХ и ГОО , часто встречающихся в опухолевых клеточных линиях, привело к обнаружению новых генов, контролирующих злокачественную трансформацию. Так, открытый данным методом проонкоген HER-2/neu , или c-erbB-2 , амплифицирован в 58 случаях из 257 изученных аденокарцином ( Rabbitts T.H., Rabbitts P.H., 1989 , Boerresen A.-L. et al., 1990 ).
Другим важным открытием, сделанным при изучении амплифицированных областей генома клеток нейробластомы , было обнаружение нового гена myc-семейства - N-myc ( Schwab M. et al., 1983 ). Его амплификация была обнаружена в клетках 22 из 63 исследованных пациентов с нейробластомой: 100-300-кратная - у 12 больных и 3-10-кратная - у 10, при этом большая степень амплификации соответствовала более продвинутой стадии заболевания ( Brodeur G. M. et al., 1984 ).
В клетках мелкоклеточного рака легкого в амплифицированных районах был найден еще один ген из этого семейства - L-myc ( Jonhson B.E. et al., 1988 ). Все три гена, c-myc, N-myc и L-myc, часто находят в амплифицированной форме в опухолевых клетках легкого . Так, при изучении 31 клеточной линии опухоли легкого в 14 из них была показана амплификация одного из данных генов, причем большая степень амплификации также была характерна для продвинутых стадий малигнизации .
Напомним, что увеличение количества белкового продукта генов myc-семейства наблюдается во многих опухолях и трансформированных клеточных линиях и может быть вызвано различными причинами (вирусной интеграцией, транслокацией и амплификацией). Кроме того, повышение содержания мРНК и белка myc-генов находят в опухолях человека даже в отсутствие его амплификации и специфических хромосомных транслокаций ( Huber B.E. et al., 1985 , Rodriguez-Alfageme C. et al., 1992 ).
Из всего выше сказанного видно, что в отличие от семейства ras-генов , активация которых в подавляющем большинстве случаев происходит за счет качественных изменений (мутаций в структурном гене), онкогенный потенциал генов myc-семейства в основном определяется количественными изменениями белкового продукта.
