ДНК-диагностика моногенных наследственных заболеваний: косвенная
Существует огромное количество наследственных болезней, для которых мутации не описаны либо не найдено мажорных мутаций в исследуемых популяциях. Даже во всех тех случаях, когда имеются мажорные мутации, наряду с ними описаны многочисленные редко встречающиеся (вплоть до единичных случаев) так называемые минорные мутации . Кроме того, всегда сохраняется возможность присутствия у пробанда неизвестных мутаций, а клонирование гена больного человека для целей прямого секвенирования, даже ограниченного только смысловой его частью - кДНК, не всегда возможно.
Эти трудности преодолеваются благодаря наличию непрямых (косвенных) методов молекулярной диагностики. Этот исторически более ранний подход основан на использовании сцепленных с геном полиморфных маркеров, с помощью которых проводится идентификация мутантных хромосом (точнее хромосом, несущих мутантный ген) в семьях высокого риска, т. е. у родителей больного и его ближайших родственников. Косвенные методы молекулярной диагностики принципиально возможны практически для всех моногенных заболеваний с известной локализацией контролирующего гена, для каждого из которых разработана удобная система вне- и внутригенных полиморфных индексных маркеров.
Косвенные методы молекулярной диагностики пригодны даже для тех болезней, гены которых еще не идентифицированы и мутации неизвестны. Единственным и непременным условием этого является наличие полиморфных сайтов рестрикции либо коротких тандемных повторов, типа STR , находящихся в непосредственной близости от мутантного гена или, что еще лучше, внутри него (чаще всего в интронах). При помощи этих полиморфных сайтов удается маркировать мутантные аллели гена и проследить их передачу потомству. Ранние исследования непрямым методом проводились почти исключительно с использованием полиморфных сайтов рестрикции - двухаллельной системы, информативная емкость которой не превышает 50%, а реальная частота гетерозигот по данному признаку в популяции оказывается существенно ниже 0,5. Следовательно, в лучшем случае только половина гетерозиготных носителей наследственного заболевания, вызванного рецессивной мутацией какого-нибудь гена, могла быть доступна непрямой молекулярной диагностике с использованием одного полиморфного сайта рестрикции. Повышение информативности в случае ПДРФ-анализа могло быть достигнуто только путем увеличения числа полиморфных сайтов. Как правило, для диагностики необходим не один, а 3 - 4 полиморфных сайта, что не всегда возможно. Многие из полиморфных сайтов локализованы вне генов на расстояниях, при которых кроссинговер может в заметном проценте случаев исказить результаты диагностики. Кроме того, практическое использование рестрикционных сайтов зачастую затруднено из-за отсутствия или большой стоимости соответствующих эндонуклеазных рестриктаз.
Эти недостатки могут быть устранены при использовании в качестве молекулярных маркеров высокополиморфных тандемно повторяющихся коротких три- и тетрамерных повторов ( STR ). Для многих генов найдены уникальные паттерны полиморфных аллелей, отличающихся по числу "коровых" единиц повторяющихся последовательностей нуклеотидов. Такие "количественные" полиморфизмы широко распространены по всему геному и присутствуют в интронных и фланкирующих областях многих генов.
Появление в конце 1994 г. 0,7 сМ-ой карты генома человека, построенной на базе высокополиморфных динуклеотидных (С-А)n- повторов, сделало реальным маркирование практически любого картированного гена. Особенную диагностическую ценность представляют внутригенные маркеры, для которых резко снижена вероятность кроссинговера с мутантными аллелями гена, а следовательно, особенно высока точность диагностики. Кроме того, многие внутригенные полиморфные короткие тандемные повторы обнаруживают сильное неравновесие по сцеплению с определенными мутантными аллелями гена, что значительно облегчает их идентификацию в отягощенных семьях. Индекс гетерозиготности таких полиаллельных мини- и микросателлитных систем нередко превышает 0,8. Их применение позволяет маркировать, т. е. сделать информативными для ДНК-диагностики, практически все семьи высокого риска при условии наличия больного ребенка или доступности для молекулярного анализа его патанатомического материала.
Изучение полиморфных маркеров у больного и его родителей и выяснение аллельной природы молекулярного маркера, так называемое "определение фазы сцепления", составляет основу для дальнейшей диагностики косвенными методами [ Евграфов О.В., Макаров В.Б., 1987 ]. Применение косвенных методов молекулярной диагностики предусматривает также в качестве обязательного предварительного этапа исследование частоты аллелей соответствующих полиморфных сайтов в анализируемых популяциях, среди больных и гетерозиготных носителей мутаций, а также определение вероятности рекомбинации и неравновесности по сцеплению между маркерными сайтами и мутантными аллелями гена. Такие исследования проводятся с помощью методов блот-гибридизации по Саузерну либо ПЦР . В первом случае в распоряжении исследователя должны быть соответствующие ДНК-зонды, во втором - должны быть известны нуклеотидные последовательности районов ДНК, включающие соответствующие полиморфные сайты, для выбора олигопраймеров.
текст к прямой днк-диагност
ть, что позволяет одновременно тестировать сразу несколько (до 30 и более) различных мутаций. При этом появляется реальная возможность выявлять свыше 95 - 98% мутантных хромосом, что делает целесообразным и экономически оправданным скринирование всей популяции отдельных стран на выявление мутантных особей для последующей организации эффективных профилактических мероприятий, направленных на предупреждение рождения больных детей. Подобные программы по муковисцидозу успешно проводятся в ряде стран Западной Европы (в Великобритании, Дании, Франции) и Северной Америки.
Преимущество прямого метода - высокая, доходящая до 100%, точность диагностики и отсутствие необходимости анализа всей семьи на предмет ее информативности. Последнее обстоятельство особенно важно для проведения пренатальной диагностики тяжелых, зачастую летальных наследственных болезней (муковисцидоза, миодистрофии Дюшенна, гемофилии А и др.). Такие семьи нередко обращаются за медико-генетической помощью уже после того, как больной ребенок умер. Так, до 80% семей с высоким риском муковисцидоза обращаются по поводу необходимости дородовой диагностики уже после смерти больного ребенка [ Baranov V.S. et. аl., 1992 ].
