Регуляция активности высокоошибочных ДНК-полимераз белками
Склонные к ошибкам ДНК-полимеразы взаимодействуют с белковыми факторами процессивности, которые стимулируют их активность. Известно, что мутации по домену, взаимодействующему с бета-димером, фактором процессивности E. coli, приводят к снижению способности склонных к ошибкам ДНК-полимераз Рol IV и Рol V осуществлять синтез ДНК в поврежденных участках [ Beсherel, 2001 ].
Фактор процессивности эукариот и архей, PCNA (антиген ядра пролиферирующих клеток) , взаимодействует как с высокоточными репликативными ДНК-полимеразами, комплексом мисматч- репарации, так и со многими высокоошибочными ДНК-полимеразами эукариот: Рol эта и Рol йота [ Haracska, 2001 ], Рol каппа [Haracska, 2002 ], Рol лямбда [ Dionne, 2003 ; Maga, 2002 ]. PCNA стимулирует активность Рol эта у дрожжей и у человека в 10-15 раз, причем, это достигается не за счет увеличения процессивности, как в случае с высокоточными ДНК-полимеразой эпсилон и ДНК-полимеразой дельта , а вследствие непосредственного стимулирования способности включать нуклеотиды в ДНК за счет повышения сродства фермента к dNTP [ Haraska, 2001 ].
Работа различных высокоошибочных ДНК-полимераз также может координироваться PCNA непосредственно на ДНК. Было показано, что Pol эта константно находится в ядре, ключевую роль играет при этом 70 аминокислотный остаток [ Kannouche, 2001 ]. В S-фазу клеточного цикла ДНК- полимераза ассоциируется с репликативной вилкой и ее количество в вилке возрастает, если репликация блокируется повреждениями ДНК. Ключевую роль в перемещении в репликативную вилку играет 50 аминокислотный остаток и взаимодействие с PCNA .
Иccледования на Saccharomyces serevisiae показали, что PCNA, в зависимости от событий клеточного цикла и уровня повреждений ДНК, может различно модифицироваться по 164 остатку лизина: моноубиквитинироваться, полиубиквитинироваться, взаимодействовать с SUMO [ Hoege, 2002 ]. Это может использоваться в качестве механизма выбора того или иного пути репарации. Для полиубиквитинирования требуется присутствие Rad5 , Ube13 , Mms2 белков . Если эти белки в клетке отсутствуют, то репарация принимает высокоошибочный характер.
Имеются также многочисленные сообщения о возможности моно- и полиубиквитинорования PCNA человека [ Kannouche, 2004 ; Watanabe, 2004 ; Motegi, 2006 ; Unk, 2006 ; Chiu, 2006 ]. Все четыре человеческие ДНК-полимеразы Y-семейства могут взаимодействовать с убиквитинированным и неубиквитинированнным PCNA, однако с различной степенью афинности. Например, Pol эта , сильнее взаимодействует с моноубиквитинированным PCNA, чем с неубиквитинированным. Таким образом, убиквитинирование PCNA в областях репликативной вилки, содержащих повреждения, может "физически привлечь" Pol эта [ Kannouche, 2004 ; Watanabe, 2004 ; Plosky, 2004 ; Friedberg, 2005 ; Lehmann, 2007 ]. Показано, что важную роль во взаимодействии склонных к ошибкам ДНК- полимераз с PCNA играет PCNA-связывающийся белок-посредник PIP [ Haracska, 2001 ; Ogi, 2005 ].
Другие белки также могут помочь в выборе сайта повреждения ДНК: ssb (single-strand binding protein) и RecA-белок у E. coli. Предполагается, что эти белки играют определенную роль в репарации во время гомологичной рекомбинации, т.к. одноцепочечная ДНК подвергается при рекомбинации мутагенезу с вовлечением склонных к ошибкам ДНК- полимераз в 100 раз чаще, чем двухцепочечная [ Federico, 1990 ; Pham, 2001 ; Reuven, 2001 ]. Возможно, сходную роль играет гомолог RecA у эукариот - Rad51 белок .
Наконец, говоря о роли белок-белковых взаимодействий в регуляции активности и работы склонных к ошибкам ДНК-полимераз, стоит упомянуть фермент Rev1 . Существуют доказательства того, что роль Rev1 в репликации поврежденных участков ДНК может быть скорее структурная и регуляторная нежели каталитическая. У мыши и человека Rev1 взаимодействует с Pol эта , Pol йота и Pol каппа [ Guo, 2006 ; Tissier, 2004 ]. Rev1 взаимодействует с PCNA (независомо от белка PIP ) и содержит убиквитин-связывающий домен [ Guo, 2006 ]. Таким образом, Rev1 , PCNA и убиквитин могут взаимодействовать друг с другом и, кроме того, все три могут взаимодействовать с Pol эта , Pol йота и Pol каппа . Показано, что фосфорилирование Rev1 у S. cerevisiae зависит от фазы клеточного цикла [ Sabbioneda, 2007 ; Waters, 2006 ].
Некоторые структурные мотивы склонных к ошибкам ДНК-полимераз, участвующие в сложной системе белковых взаимодействий, представлены на рис. 2 .
Таким образом, многоуровневая система регуляции активности и взаимодействия между различными высокоошибочными ДНК-полимеразами и белковыми факторами может обеспечивать основу - структурную платформу для механизма переключении ДНК-полимераз во время репликации поврежденной ДНК. Однако, несмотря на сложность и многообразие путей регуляции работы этих ферментов, выбор той или иной высокоошибочной ДНК- полимеразы непосредственно в репликативной вилке, вероятно, также определяется спецификой и типом повреждения ДНК. Этот выбор не может быть лишен случайности и зависит во многом от концентрации ферментов в ядре и их непосредственной близости от репликативной вилки. Очевидно, между ДНК-полимеразами существует локальная конкуренция за сходные повреждения [ Becherel, 2001 ].
Согласно общепринятой модели репликации [ Goodman, 2002 ], при появлении в той или иной цепи ДНК повреждения происходит замена блокированной точной репликативной ДНК-полимеразы на какую-либо специализированную высокошибочную ДНК-полимеразу. Замена полимераз будет идти эффективнее, если комплекс ферментов, участвующих в ДНК-репликации фиксирован, иммобилизован в пространстве. При этом ДНК будет двигаться между ферментами, а не ферменты двигаться по ДНК, как считалось долгие годы ранее. При помощи методов флуоресценции, гибридизации и классических биохимических методов, направленных на поиски белок-белок и белок-ДНК взаимодействий при репликации, у Bacillus subtilis было показано, что ДНК, в самом деле, может двигаться через "заякоренные" полимеразы [ Lemon KP., et. al., 1998 ].
