Кинетика полимеризации NM и Sup35
In vitro при растворении чистого мономерного NM (см. " Sup35 ") спонтанная полимеризация начинается спустя некоторое время, и примерно через 50 часов половина белка находится в полимерной форме ( Serio et al. 2000 ). Началу процессу полимеризации, отслеживаемому по связыванию Конго красного, предшествовует лаг-фаза, на протяжении которой полимеры в растворе не обнаруживаются (приблизительно 20 часов). Если реакция затравляется готовыми полимерами, то лаг фаза исчезает, и полимеризация происходит примерно в 10 раз быстрее. Если "семена" (затравки, "конденсационные ядра полимеров", Griffith, 1967 ) предварительно раздробить ультразвуком, то скорость полимеризации возрастет еще в 10 раз. Таким образом, конверсию в этих условиях лимитирует число концов, доступных для полимеризации.
При помешивании реакционной смеси на качалке (60-80 rpm) в незатравленных реакциях лаг-фаза сокращается в 100 раз, и в 100 раз увеличивается скорость полимеризации. В реакциях с затравлением помешивание увеличивает скорость полимеризации в 10 раз, а при использовании дробленых ультразвуком затравок помешивание не имеет эффекта. Следует отметить, что помешивание не фрагментировало фибриллы и не создавало новых концов.
Для объяснения этих результатов авторы предположили наличие олигомерного интермедиата, который медленно формируется во время лаг фазы. С малой вероятностью такие олигомеры могут переходить в прионную форму и служить затравками для дальнейшей полимеризации. Поскольку образовавшихся "семян" немного, количество концов полимеризации является лимитирующим, и скорость полимеризации гораздо меньше, чем в затравленных реакциях. При помешивании, по всей видимости, образование интермедиата происходит гораздо более эффективно, что приводит к сокращению лаг-фазы. В результате происходит быстрое увеличение пула зрелых олигомеров, и их массовая конверсия в прионную конформацию. "Семян" оказывается так много, что скорость полимеризации становится в 10 раз больше скорости в обычных затравленных реакциях и оказывается сравнима со скоростью полимеризации с дроблеными затравками. По мнению авторов эффект помешивания заключается в диссоциации крупных неспецифических комплексов, неспособных к конверсии, и/или в увеличении частоты столкновения олигомерных интермедиатов друг с другом и с концами фибрилл ( Serio et al. 2000 ). Можно предположить, что прионная конверсия зрелых олигомеров происходит при их столкновении друг с другом и сопутствующем образованием "минимальной фибриллы".
Также оказалось, что если выдержать раствор мономера до добавления "семян", то появляется фаза быстрой полимеризации, в которой скорость конверсии оказывается примерно в 40 раз быстрее затравленных реакциий без преинкубации. Что можно объяснить формированием большого количества олигомерных интермедиатов, способных присоединяться к затравкам.
Таким образом, можно различать 2 типа полимеризации - быструю олигомерную и более медленную мономерную.
При применении антител к олигомерным формам Aбета-40 показана реакция антител и с олигомерным интермедиатом NM и Sup35. Продемонстрировано также, уже на полноразмерном Sup35, накопление олигомера в лаг-фазе и быстрое исчезновение после начала полимеризации ( Shorter, Lindquist, 2006 ). Кроме того, добавление специфических антитител перед началом незатравленной полимеризации ингибрует ее, тогда как на затравленную полимеризацию добавление антител не влияет. Также имеются специфичные к полимерной конформации антитела, полученные при иммунизации Aбета-40, которые также распознают фибриллы ряда других белков, в том числе Sup35. Эти антитела не реагирют с олигомерами и мономерами и ингибируют как затравленные, так и незатравленные реакции ( Shorter, Lindquist 2004 ).
Следует отметить, что, по крайней мере при использовании NM, общее количество олигомерных форм оставалось постоянным на протяжении лаг- фазы, однако олигомерные интермедиаты, распознаваемые специфическими антителами, отсутствовали в начале и накапливались к моменту начала полимеризации. Вероятно именно процесс превращения "незрелых" олигомеров в "зрелые" требует изменения конформации и определяет продолжительность лаг-фазы. По гипотезе, предложенной Serio et al. 2000 , мономеры Sup35 и NM обладают повышенной конформационной "текучестью" ( Mukhopadhyay et al. 2007 ). Множество возможных конформационных форм делает маловероятным существование какой-либо конформации, пусть даже и более стабильной, поскольку прийти к ней можно только путем перебора большого количества конформационных состояний - парадокс Левинталя ( Serio et al. 2000 ). Авторы считают, что олигомерное состояние снижает число возможных конформаций, ускоряя тем самым достижение стабильной прионной укладки.
Размер олигомеров Sup35 около 20-40 нанометров, размер олигомеров NM - 2-4 нанометра (визуализация электронно-микроскопическими методами; Shorter, Lindquist 2006 ). Неясно, может ли такая разница объясняться разностью размеров мономеров Sup35 и NM, т.к. С домен (см. " Sup35 ") составляет только половину белка Sup35. Олигомер Sup35 состоит приблизительно из 20-80 мономеров. По данным электронной микроскопии он имеет округлую форму и пору посредине. Показано, что сходную структуру имеют и олигомеры других амилоидных белков ( Lashuel et al. 2002 ).
Надо отметить, что полимеризация in vitro показана также для Rnq1 и Ure2 и они также имеют олигомерные интермедиаты при незатравленном возникновении de novo. Для Ure2 кинетика возникновения и исчезновения олигомеров очень похожа на таковую для Sup35, однако олигомеры Ure2 не взаимодействуют с антителами к олигомеру, поэтому нельзя с полной уверенностью утверждать что они необходимы для возникновения de novo.
Роль олигомерного интермедиата in vivo не совсем ясна, поскольку показано, что при затравленной полимеризации мономер присоединяется к фибриллам по одной молекуле ( Collins et al. 2004 ). In vivo возникновение приона de novo без затравления гомологичными или гетерологичными полимерами пока показать не удалось, cоответственно олигомерные интермедиаты, возможно, играют роль только in vitro.
