Взаимодействия прионов с шапероном при образовании de novo
Рассмотрим взаимодействия с шапероном при образовании de novo и поддержании приона. Фрагментирующая активность шаперонов определяет прионное и амилоидное состояние (см. " Шапероны: образование и распад агрегатов глутамин-богатых белков "). Для прионных белков дрожжей основным регулирующим шапероном является Hsp104 . Делеция его гена элиминирует все естественные прионы дрожжей . Hsp104 - это гомогексамер, у которого на каждом мономере имеется два АТФ связывающих домена. Известно, что для осуществления различных активностей in vivo Hsp104 требуются кошапероны ( Hsp70 , Hsp40 , Hsp26 ) ( Glover, Lindquist 1998 ; Haslbeck et al. 2005 ). Однако активности Hsp104, связанные с возникновением и поддержанием [Psi+] и [Ure3+] наблюдаются in vitro без присутствия кошаперонов ( Shorter, Lindquist 2006 ). Никаких доказательств абсолютной необходимости кошаперонов для осуществления этих активностей in vivo также не получено. тем не менее имеются примеры модулирующего влияния кошаперонов на фукнции Hsp104, связанные с прионами ( Glover, Lindquist 1998 ). Интересно, что активности Hsp104, не связанные с прионами и требующие присутствия кошаперонов, могут быть воспроизведены in vitro без них при использовании смеси АТФ со слабо- гидролизуемым аналогом АТФ-гамма-S ( Doyle et al. 2007 ). Авторы предполагают, что увеличенное время посадки шаперона на мишени позволяет ему осуществлять свои активности без участия кошаперона.
Добавление Hsp104 + АТФ приводило к исчезновению лаг-фазы и немедленному появлению зрелых олигомеров в растворах NM и к значительному укорочению лаг-фазы для полного Sup35 . Таким образом, полимеризация протекала практически с кинетикой затравленной реакции . Этот эффект поддерживается также негидролизуемыми аналогами АТФ, но не АДФ, т.е. достаточно связывания АТФ, а собственно гидролиз не требуется ( Doyle et al. 2007 ). Мутант Hsp104, неспособный к гексамеризации, не влияет на кинетику полимеризации.
Вероятно Hsp104 способствует созреванию олигомеров, связываясь с ними и ограничивая набор возможных конформаций, при этом, если прионная конформация остается в наборе разрешенных состояний, то она будет достигаться быстрее.
Также оказалось, что Hsp104 ускоряет и затравленную полимеризацию . Скорее всего это происходит из-за расщепления фибрилл, что создает новые концы для полимеризации, повторяя таким образом эффект ультразвуковой фрагментации фибрилл ( Serio et al. 2000 ). Для этой активности необходим гидролиз АТФ. Несмотря на то, что in vivo шапероны Hsp40, Hsp70 влияют на полимеризацию NM и Sup35 ( Glover, Lindquist 1998 ), in vitro они не способны стимулировать полимеризацию и деполимеризацию.
Еще один эффект Hsp104 проявляется только при высоких концентрациях шаперона (5:1, Sup35:гексамеры Hsp104, т.е. около 1 мкМ Hsp104). Это блокирование полимеризации, которая в этих условиях даже не начинается. Блокируется также появление зрелых олигомеров. Эффект наблюдается в присутствии АТФ, и негидролизуемых аналогов, но не проявляется при добавлении АДФ. Исходя из того, что нуклеотидные требования этой активности те же, что и для формирования зрелого олигомера, можно думать, что оба эффекта являются результатом одной и той же реакции. Например, столкновение шаперона с незрелым олигомером может закончиться либо его обращением в зрелую конформацию, либо распадом. Зрелая конформация может быть также разрушена шапероном. Таким образом, при высоких концентрациях Hsp104 время жизни олигомеров может быть просто недостаточно для осуществления конверсии. Другое предположение заключается в том, что возможное связывание олигомера Sup35 с несколькими гексамерами Hsp104 ограничивает набор возможных конформаций настолько, что конформация зрелого олигомера и/или прионная конформация уже не входит в число разрешенных вариантов. Модификацией этого же сценария является простое связывание Hsp104 с мономером Sup35 или NM, которое затрудняет олигомеризацию.
Следует отметить возможную разницу механизмов ускорения полимеризации при помешивании и добавлении шаперона. Оба приема одинаково ускоряют появление зрелых олигомеров. Однако ускорение собственно полимеризации может достигаться разными способами: при помешивании происходит массовая конверсия зрелых олигомеров с образованием множества "семян", а шаперон просто дробит немногие образовавшиеся полимеры, создавая новые концы. По этой модели шаперон не принимает непосредственного участия в прионной конверсии. При образовании de novo в растворе мономера, она может происходить вследствие соударения и/или димеризации олигомеров.
