Шапероны: образование и распад агрегатов глутамин-богатых белков
Показано, что делеция гена Hsp104 приводит к потере всех известных прионных детерминант дрожжей, однако существует искусственная конструкция с заменой N домена (см. " Sup35 Белок ") на глутамин- тирозиновый тракт, не теряющая способность к образовыванию приона без этого шаперона. По результатам SDD-AGE делеция Hsp104 сопровождается увеличением размера полимеров ( Kryndushkin et al. 2003 ). Механизм потери приона при делеции предположительно таков: шаперон фрагментирует фибриллы, создавая тем самым "семена", в виде которых наследуется прион. Если фрагментации не происходит, то все полимеры с некоторой вероятностью собираются в один крупный и плотный агрегат, который при делении попадает только в одну клетку. Таким образом рано или поздно прионное состояние будет потеряно.
Подобным образом действует гуанидин-гидрохлорид. В высоких концентрациях это соединение является денатурирующим агентом, при низких концентрациях оно неконкурентно ингибирует Hsp104 и возможно другие шапероны. При выращивании клеток на среде с гаунидином за несколько поколений происходит потеря прионных детерминант.
Оверэкспрессия гена Hsp104 также приводит к увеличению частоты потери прионной детерминанты для Sup35. В слабых штаммах прион теряется полностью. [Pin+] и [Ure3] в этих условиях не теряются. Механизм потери не до конца ясен. Логично было бы предположить, что при оверэкспрессии шаперон полностью разбирает агрегаты белка, и весь Sup35 переходит в мономерную форму. Однако показано, что оверэкспрессия шаперона не сопровождается исчезновением SDS-устойчивых полимеров, более того, их размер растет ( Kryndushkin et al. 2003 ). Что можно объяснить сильным увеличением пула мономеров при слишком активном расщеплении шапероном; увеличением, происходящем за счет преимущественного расщепления коротких полимеров, более доступных в агрегате из-за небольшой длинны латеральных контактов. В результате мелкие фрагменты эффективно разрушаются до мономеров, а длинные полимеры растут, что приводит к образованию более плотного и трудно фрагментируемого агрегата. Получается, что количество доступного мономера в нормальных условиях лимитирует скорость полимеризации, и при оверэкпрессии увеличение скорости полимеризации "перевешивает" избыток щепящей активности.
Эта парадоксальная интерпретация неожиданным образом была подтверждена опытами Lindquist ( Shorter, Lindquist, 2006 ) in vitro. В этой работе предварительно сформированные полимеры Sup35 при добавлении больших количеств Hsp104 примерно на 60% переходили в мономерную форму, но 40% белка оставалось в составе плотных агрегатов, которые оказались неинфекционными и не затравляли полимеризацию в растворах Sup35 в отсутствии Hsp104. Стоит отметить, что агрегаты Ure2 тоже разбирались, однако устойчивые к разборке конечные продукты сохраняли инфекционность и способность служить затравкой, что коррелирует с тем, что, в отличие от Sup35, Ure2 не теряется при оверэкспрессии Hsp104. Таким образом действительно, избыток щепящей активности не вызывает полного растворения агрегатов.
Загадочной является неспособность этих агрегатов служить затравкой для полимеризации. Можно предположить, что образуются настолько плотные агрегаты, что большая часть концов, доступных для полимеризации каким-то образом становится недоступной. К сожалению, авторы не попытались раздробить эти агрегаты ультразвуком и испытать их затравляющую активность после этого. Обычно дробление агрегатов приводит к сильному увеличению их затравляющей активности, поскольку увеличивается число концов полимеризации. Другое объяснение заключается в том, что в системе с высокими скоростями полимеризации и деполимеризации возникают селективные условия для смены варианта приона на более слабый. Отметим, что в этих экспериментах использовались фибриллы, сформированные при 25 градусах по С, а в этих условиях in vitro формируется именно слабый вариант. Если в растворе с малой частотой может происходить конверсия в более слабую прионную форму (de novo или в результате "ошибок" полимеризации), и более слабая форма менее подвержена расщеплению, то остаточные агрегаты могут состоять из нещепящейся, супер-слабой формы, по свойствам более напоминающей амилоид , который, в отличие от приона, не расщепляется шаперонами и не наследуется. То есть в экспериментах Lindquist прион фактически мог превращаться в амилоид.
