Определение силы варианта приона
Наличие вариантов - важнейшая особенность прионных белков. Проведен сравнительный анализ эффективностей конверсии для различных вариантов ( Uptain et. al. 2001 ). Мономерный NM затравлялся in vitro с помощью фибрилл Sup35 из сильных и слабых штаммов. Анализ скорости полимеризации проводился по изменению флуоресценции тиофлавина Т при включении в полимер. Для количественного определения силы варианта измерялись концентрации мономера в супернатанте после ультрацентрифугирования. Чем больше мономера было в супернатанте, тем слабее вариант. Оказалось, что Sup35, выделенный из сильных штаммов, конвертирует NM примерно в 20 раз более эффективно, чем затравки из слабых штаммов. Авторы предложили два объяснения. Во-первых, различные скорости конформационного перехода для разных вариантов, и, во-вторых, разное число концов полимеризации затравок. В пользу второго предположения имеются прямые доказательства. При анализе длин полимеров SDD-AGE электрофорезом ( Kryndushkin et al. 2003 ) показано, что полимеры слабых штаммов значительно длиннее сильных, следовательно, в слабых затравках концов полимеризации меньше. В пользу первого объяснения пока нет четких данных. Однако они не противоречат друг другу.
Важно понять, какой же домен приона обуславливает вариант, и как именно обеспечивается сила варианта. Показано, что при сборке мономеров NM in vitro при разной тепмпературе возникали варианты разной силы ( Kamen et al. 2000 ; Shorter, Lindquist, 2006 ). Во время полимеризации при 4 градусах по С возникают сильные варианты, при комнатной температуре - слабые. Что было подтверждено и дополнено в исследовании ( Krishnan, Lindquist, 2006 ). В работе использовались довольно оригинальные методы выяснения тонкой структуры фибрилл NM, динамики их сборки и особенностей различных вариантов. Была получена серия мутантов Sup35-NM, где в каждом одну аминокислоту заменяли на цистеин (37 замен в разных местах по всей длине NМ). В норме в NM домене цистеин отсутствует. Эти точечные замены никак не изменили поведения белка при полимеризации, при условии наличия в буфере DTT. Белок полимеризовался со сходной кинетикой и образовывал фибриллы, неотличимые от фибрилл NM.
Была также проведена проверка на доступность цистеинов для мечения красителями пирен малеимидом и Люциферовым желтым (более гидрофильный краситель), которая показала, что в полимерах аминокислоты от 25 до 58 практически недоступны для красителя, с 2 по 21 и с 68 по 112 доступны частично, а цистеины М домена хорошо доступны. Результаты получены на фибриллах, сформированных при 25 градусах по С. Чтобы определить, насколько соответствующие цистеины экспонированы в окружающий растворитель, был также использован акриладан. Флуоресценция акриладана возрастает и сдвигается в синюю область, когда он изымается из растворителя. Выяснилось, что аминокислоты 21-121 изъяты из раствора, прилегающие остатки 7 с N конца и 137, 158 и 167 c C конца были изъяты частично. Район 21-121 разворачивается кооперативно при денатурации полимера ступенчатыми концентрациями гаунидин-хлорида. Из этих результатов понятно, что большая часть N домена в полимерах закрыта от растворителя, и непрерывный сегмент 21-121 свернут в плотную структуру, полностью закрытую в полимерах Sup35.
Для картирования межмолекулярных контактов был вновь применен пирен малеимид, способный образовывать эксимеры (димеры в возбужденном состоянии). При нахождении двух остатков пирена на близком расстоянии один возбужденный остаток может передавать энергию на другой, в результате возникает заметный сдвиг в красную область. С помощью этого красителя были выявлены зоны межмолекулярных контактов для фибрилл, образованных при 25 градусах по С, которые названы голова (25-38) и хвост (91-106) . Район от 48 до 85 ак не участвует в контактах между мономерами, и полностью спрятан внутри, поэтому именуются " центральным кором ". Выяснилось также, что контакты между мономерами происходят по схеме голова-к-голове, хвост-к-хвосту.
Далее с помощью вышеперечисленных красителей были исследованы фибриллы слабых и сильных вариантов. Выяснилось, что варианты отличаются по степени доступности некоторых аминокислот. Так, в сильном варианте, который образуется при 4 градусах по С, закрыты от растворителя и разворачиваются кооперативно аминокислоты (АК) с 31 по 86, а в слабом (25 градусах по С) - с 21 по 121. Анализ свечения эксимеров показал различную вовлеченность АК в районе с 73 до 121 в межмолекулярные контакты в полимерах сильных и слабых штаммов. Авторы считают, что у сильных и слабых штаммов различна длина плотного контакта между мономерами, причем у слабых штаммов контакт существенно длиннее, чем у сильных. По мнению авторов этим объясняется более легкая денатурация фибрилл сильных штаммов при высоких концентрациях гаунидин-хлорида. Они также склонны объяснить различия в степени фрагментации фибрилл Hsp 104 тем, что короткие контакты расщепляются легче длинных.
Однако существует и другой аспект. Сравнение поведения икусственных прионных белков, содержащих поли-Q и поли-QY тракты позволяет предположить, что наличие тирозинов делает прионный домен более привлекательным для шаперона ( Александров И.М. 2006 ). В.Кушнировым высказана гипотеза, что различные конформации Sup35 в фибриллах отличаются по степени экспозиции в растворитель тирозинов и таким образом по их привлекательности для шаперона. Из этого следует, что в сильных, хорошо фрагментирующихся полимерах должно быть экспонировано больше тирозинов, чем в слабых, плохо щепящихся. Приведенные выше данные ( Krishnan, Lindquist 2005 ) показывают, что части N домена, экспонированные у сильных штаммов, спрятаны у слабых. В этих дифференциально экспонированных участках присутствует по крайней мере 5 остатков тирозина, в то время как остальные тирозины N домена упакованы в центральный кор и недоступны, за исключением двух остатков на N конце (а.к. 13, 15). Таким образом, конформация сильных штаммов обеспечивает значительный выигрыш в экспозиции тирозина и может являться значительно более привлекательной для шаперонов.
Использование цистеиновых линкеров позволило выяснить, что сближение "головы к голове" (см. " Определение силы варианта приона ") стимулирует полимеризацию и практически элиминирует лаг-фазу ( Krishnan, Lindquist 2005 ). Линкирование центральных коров полимеризацию блокирует, поскольку мешает сворачиванию кора в плотную, недоступную для растворителя структуру. Интересно, что при линкировании "головы с головой" возникали преимущественно сильные варианты, а при линкировании "хвоста с хвостом" - преимущественно слабые, при этом линки между соответствующими зонами пересиливали влияние температуры на формирование соответствующего варианта. Это подтверждает вывод о том, что в сильных вариантах хвосты слабо вовлечены в межмономерные контакты.
