Прионные свойства белка Sup35: общие сведения
В 1994 г. Wickner предположил, что генетические свойства детерминантов [URE3] и [PSI+] могут быть объяснены в рамках прионной концепции ( Wickner, 1994 ). Поскольку [URE3] зависел от гена URE2 , а [PSI+] - от гена SUP35 , то на роль соответствующих прионов могли претендовать кодируемые этими генами белки, а именно, Ure2 для [URE3] и Sup35 для [PSI+]. Это допущение позволило логично объяснить все парадоксальные свойства детерминантов.
Одним из наиболее удивительных свойств обоих детерминантов является обратимость их потери: они могут возникать de novo. Эта особенность не согласуется с гипотезами, подразумевающими присутствие автономного генома. Прионная гипотеза легко объясняет этот факт: клетка, лишившаяся какого-либо из этих детерминантов, теряет способность поддерживать необычную конформацию соответствующего белка, а значит, если такая потеря не была связана с мутациями в генах URЕ2 и SUP35, то белки, кодируемые этими генами, могут с какой-то вероятностью вновь перейти в прионную форму ( Cox et al, 1988 ).
Доминантный характер наследования детерминантов [URE3] и [PSI+] также легко объясняется этой гипотезой. При скрещивании клеток дрожжей, одна из которых имеет [URE3] или [PSI+] (прионную форму соответствующего белка), а другая лишена их, происходит смешивание цитоплазмы. При этом белок в прионной форме передает свою необычную конформацию нормальной изоформе белка гибридной клетки, что приводит к образованию фенотипа, характерного для соответствующего детерминанта ( Cox et al, 1988 ).
Как и в случае PrPSc , делеция гена URE2 и делеция 5'-концевого района гена SUP35, приводят к потере соответствующих детерминантов, поскольку такие мутанты не синтезируют белки, подверженные конформационной перестройке. Напротив, повышение концентрации белков Ure2 и Sup35 в клетках дрожжей увеличивает частоту индукции состояния [URE3] и [PSI+], соответственно, так как при увеличении количества молекул, подверженных перестройке, растет вероятность того, что какая- либо из них спонтанно изменит конформацию.
Прионная природа детерминанта [PSI+] подтверждается и тем, что [PSI+] обратимо теряется с высокой частотой при низких концентрациях GuHCl и метанола ( Tuite et al., 1981 ), и способен возникать de novo в штаммах, из которых был изгнан, с частотой 1-100000 клеток ( Lund and Cox, 1981 ). Сверхпродукция Sup35 (или его прионного домена) увеличивает частоту возникновения [PSI+] de novo в 100 и более раз ( Chernoff et al., 1993 ; Derkatch et al., 1996 ). Поддержание [PSI+] определяется наличием гена SUP35 .
[PSI+] имеет доминантный не-Менделевский тип наследования ( Cox, 1965 ), что может быть объяснено в рамках прионной концепции. Если состояние [PSI+] возникло, оно стабильно поддерживается за счет постоянной передачи прионной конформации нативным молекулам белка Sup35. При скрещивании клеток [PSI+] и [psi-] происходит смешивание цитоплазмы, и каждая дочерняя клетка получает некоторое количество прионного Sup35, поэтому [PSI+] передается всем мейотическим потомкам. [PSI+] также передается при цитодукции .
Биохимические эксперименты также подтверждают прионные свойства Sup35. Агрегаты белка Sup35 могут быть визуализированы флуоресцентной микроскопией при сверхэкспрессии химерного белка Sup35-GFP ( GFP , Green Fluorescent Protein, зеленый флуоресцентный белок): агрегаты этого белка в клетках [PSI+] видны как светящиеся точки, в отличие от диффузного свечения в [psi-] клетках ( Patino, 1996 ). Sup35, выделенный из [PSI+] штаммов, обладает повышенной устойчивостью к обработке протеиназой К ( Patino et al., 1996 ; Paushkin et al., 1996 ). Sup35 в клетках [PSI+] находится в основном в составе больших агрегатов, тогда как в [psi-] клетках большая часть Sup35 растворима ( Patino et al., 1996 ; Paushkin et al., 1996 ).
В лизатах дрожжей было показано, что при добавлении к лизату [psi-] клеток прионных "семян" из лизата [PSI+] клеток происходит прионный переход - образование агрегатов из всей неприонной формы этого белка. Если же затем взять эти "семена" и поместить их в следующую порцию [psi-] лизата, то опять произойдет прионный переход и образование агрегатов. Такую процедуру можно осуществить неограниченное число раз. Доказательством того, что именно Sup35 из клеток [PSI+] обладает прионными свойствами, может служить то, что очистка белка до гомогенного состояния не снижает его прионообразующей способности. Анализ различных фракций, полученных в результате ультрацентрифугирования лизата клеток [PSI+] в линейном градиенте сахарозы, показал, что прионообразующее начало не связано с мономерной формой белка Sup35 и зависит от наличия во фракции агрегатов белка. Данные результаты подтверждают полимеризационную модели прионного перехода Sup35 ( Paushkin et al., 1996 , Paushkin et al., 1997b ).
Для того, чтобы показать наличие Sup35 в агрегированной форме в [PSI+] клетках in vivo, был применен зеленый флуоресцентный белок ( GFP ) ( Patino et al, 1996 ). Гибридный белок Sup35-GFP был введен в [PSI+] и в [psi-] клетки. В случае [psi-] клеток наблюдалось равномерное зеленое свечение по всему объему клетки, тогда как в [PSI+] можно было наблюдать отдельные ярко светящиеся точки (приблизительно 10 точек на клетку), в которых был сконцентрирован практически весь светящийся белок.
Демонстрация инфекционных свойств прионного белка Sup35 in vivo окончательно подтвердила прионную гипотезу. Был разработан метод белковой трансформации дрожжей и произведено "заражение" сферопластов [psi-] клеток полимеризованным рекомбинантным белком Sup35, полученным in vitro, после чего такие клетки становились [PSI+] ( Tanaka et al., 2004 ; King and Diaz-Avalos, 2004 ).
Таким образом, гипотезу о прионной природе белка Sup35 доказывают следующие экспериментальные данные:
- цитоплазматический тип наследования [PSI+];
- зависимость поддержания [PSI+] от гена SUP35;
- способность [PSI+] теряться и возникать de novo;
- увеличение частоты образования de novo происходит за счет сверхэкспрессии белка Sup35;
- выявление агрегатов гибридного белка Sup35-GFP в клетках [PSI+];
- формирование протеазо-устойчивых агрегатов белка Sup35 в клетках [PSI+];
- формирование амилоидоподобных фибрилл Sup35 in vitro, способных конвертировать мономеры Sup35 в фибриллярную форму;
- трансформация дрожжевых клеток полимерами белка Sup35 (полученными in vitro) приводит появлению [PSI+] в этих клетках.
