Терминальная остановка пролиферации (ТОП): несколько состояний
Иммортализация может рассматриваться как уход от состояния терминальной остановки пролиферации (ТОП), которое в конце концов настигает все нормальные соматические клетки. После известного феномена терминальной дифференцировки старение было первым описанным состоянием ТОП жизнеспособных клеток. В пионерской работе Хейфлика и его коллег в начале 60-х годов было сделано открытие, что нормальные диплоидные фибробласты человека пролиферируют только определенное число раз in vitro, после чего они навсегда прекращают деление и начинают стареть [ Hayflick, ea 1961 ].
Стареющие клетки могут длительно сохранять жизнеспособность. Это показывает, что процесс старения четко отличается от любой формы смерти клеток, например апоптоза, и что эти состояния необходимо различать. Старение обнаружено у многих типов клеток человека и других млекопитающих. Эти данные (см. обзор [ Cristofalo, ea 1993 ]) показывают, что старение является общим феноменом. Наблюдения, свидетельствующие, что фенотип старения доминирует над иммортализованным фенотипом [ Bunn, ea 1980 , Muggleton-Harris, ea 1980 , Pereira-Smith, ea 1981 , Pereira-Smith, ea 1983 ], многими авторами интерпретировались в том смысле, что ограниченная продолжительность жизни нормальных клеток является генетически запрограммированным процессом и что иммортализованные клетки теряют функцию одного или более предполагаемых генов старения, которые активны в нормальных клетках.
Второе состояние ТОП, известное как кризис , было описано в 1965 г. в результате исследования эффектов обезьяньего вируса 40 ( SV40 ) на фибробласты человека [ Girardi, ea 1965 ]. Нормальные клетки человеческого организма редко претерпевают (или никогда не претерпевают) спонтанную иммортализацию in vitro. Однако иммортализацию клеток можно надежно, хотя и с очень низкой частотой, вызвать онкогенными ДНК-вирусами , например SV40 и папилломовирусами (см. обзор [ Linder, ea 1990 ]).
Иммортализация клеток человека под действием SV40 протекает в две стадии.
Первая стадия ( M1 , старение ) - временное удлинение жизни: после введения в клетки сегмента ДНК, кодирующего ранние белки вируса SV40 (в том числе большой Т-антиген (LTAg) - и другие онкобелки), нормальные клетки человека претерпевают морфологическую трансформацию и продолжительность их пролиферативной жизни повышается на ~ 20-60 удвоений популяции сверх предела, при котором нормальные популяции начинают стареть. Затем эти клетки обычно приходят к состоянию кризиса, при котором не происходит общего роста популяции.
Вторая стадия ( M2 , кризис ) - достижение неограниченного пролиферативного потенциала: некоторые клетки в состоянии кризиса могут возобновить пролиферацию и стать иммортализованными. Иммортализация - редкое событие, частота которого составляет от 10-5 [ Shay ea 1993 ] до 10-9 (Э.Дункан и др., неопубликованные данные). Иммортализация, вызванная вирусом папилломы человека ( HPV - Human Papilloma Virus), также осуществляется за эти две стадии [ De Silva ea 1994 ].
Эти ранние исследования выявили существование двух состояний ТОП: старения, характерного для нормальных клеток, и кризиса, который происходит в клетках, трансформированных онкогенными ДНК-вирусами после временного избегания старения. Поэтому кризис представляется последним барьером ТОП, который клетки должны преодолеть, чтобы стать иммортализованными. Сокращения Ml и М2 (Mortality Stages 1 and 2) предложены соответственно для обозначения старения и кризиса [ Wright, ea 1989 ]. Однако обсуждаемые выше данные показывают необходимость иметь в виду, что это жизнеспособные состояния остановки, которые нельзя смешивать со смертью клеток. Недавние исследования выявили существование по крайней мере еще одного состояния ТОП. Введение доминантно- негативного мутантного гена р53 позволило фибробластам дополнительно произвести ограниченное число удвоений популяции за пределом, при котором нормальные клетки начинают стареть [ Bond, ea 1994 , Fudhimi, ea 1997 ]. Доказательства того, что этот эффект обусловлен утратой функции wt гена р53, а не просто воздействием нормального белка р53, были получены в исследованиях, показавших, что фибробласты IIICF, полученные от пациента с синдромом Ли-Фромени (LFS) и содержавшие один нуль-мутантный и один дикого типа (wt) аллели гена р53, временно избегали старения и пролиферировали дополнительно в течение 32-35 УП, после чего происходила спонтанная делеция или мутация аллеля wt [ Rogan, ea 1995 ]. В большинстве случаев эти клетки достигали состояния остановки пролиферации, из которого они уже не могли выйти [ Rogan, ea 1995 ]. Когда те же гетерозиготные р53-wt/нуль-мутантные клетки были трансформированы генами ранних белков SV40, клетки выполняли еще 60-70 УП за пределом обычного начала старения и только после этого вступали в фазу кризиса [ Maclean, ea 1994 ] ( рис 1 immort ). В одном из предыдущих исследований сделан вывод о том, что введение HPV-16 E6 (который связывает р53 и вызывает его деградацию) в нормальные фибробласты человека недостаточно для преодоления M1. Однако данные свидетельствовали о небольшом (~10 удвоений популяции) повышении пролиферативного потенциала [ Shay, ea 1993 ].
Количественные различия между числом дополнительных УП, зарегистрированные в этих исследованиях, могут отражать полноту инактивации wt p53 и/или различие генетических свойств исследованных фибробластов. Эти данные показали, что фибробласты, в которых нормальная функция р53 отменена, временно избегают старения перед вхождением в то состояние ТОП (здесь называемое р53-минус ТОП ), которое по числу удвоений популяции является промежуточным между старением и кризисом.
Таким образом, имеются по крайней мере три состояния ТОП (которые также называются контрольными пунктами продолжительности жизни [ Wynford-Thomas, ea 1997 ]), которые служат серией барьеров на пути к иммортализации ( рис 1 immort ). Еще неясно существуют ли в фибробластах дополнительные механизмы остановки и различны ли механизмы ТОП в клетках различных линий.
См. также Терминальная дифференцировка и старение (мнение Хэйфлика)
