eRF3: функции
Известно, что G-белки нуждаются в двух дополнительных белках, один из которых ( GAP ) активирует G-белок, а другой ( GEF ) резко ускоряет обмен гуаниновых нуклеотидов, связанных с G- белком (подробнее см. обзор [ Sprang, ea 1997 ]). Например, у прокариот G-белок, участвующий в элонгации ( EF-Tu ), имеет в качестве дополнительного белка фактор EF-Ts . Поскольку eRF3 нуждается для проявления GTPазной активности сразу в двух кофакторах - рибосоме и eRF1 одновременно, то эти компоненты белок-синтезирующего аппарата клетки можно рассматривать как составной GAP [ Zhouravleva. ea 1995 , Frolova. ea 1996 ]. Однако у прокариот RF3 активируется только рибосомой без участия RF1/2 [ Freistroffer, ea 1997 ], поэтому можно предположить, что роль GAP играет сама рибосома для обоих факторов. Если это так, то функция GEF может оказаться связанной с eRF1, однако пока не проведено соответствующих кинетических опытов, это предположение остается гипотетичным.
Следует подчеркнуть, что eRF3 связывает GTP без участия рибосом и eRF1 [ Frolova. ea 1996 ] и, следовательно, eRF3 содержит предобразованный участок связывания GTP, однако каталитическая активность проявляется только в четверном комплексе eRF3-eRF1-GTP-рибосома .
Биологические последствия такой ситуации весьма интересны. Если еRF3-GТР-комплекс связывается с рибосомой, то он может осуществлять только те функции, которые не требуют гидролиза GTP. Как известно, связывание GTP с G-белками сильно меняет их конформацию, что используется белками-мишенями как сигнал (см. [ Scheffzek, ea 1997 ]).
Если же с этой же рибосомой свяжется eRF1, то еRF3-GТР-комплекс может перейти в eRF3 GDP-форму, которая по аналогии с другими G-белками должна обладать другими свойствами.
Поскольку eRF1 катализирует гидролиз пептидил-тРНК без eRF3 [ Frolova, ea 1994 ], то eRF3 для реакции терминации как таковой не нужен. Однако после освобождения полипептида из пептидил-тРНК в рибосоме освобождаются три компонента, которые не нужны для начала нового цикла трансляции, - деацилированная тРНК, eRF1 и мРНК, связанная с рибосомой после терминации своим 3'-концом.
В рибосомах эукариот функцию подготовки рибосом к новому циклу трансляции (recycling) может выполнять eRF3. Однако у прокариот, как показано в последнее время [ Pavlov, ea 1997 , Pavlov, ea 1997 ], в этом процессе участвуют по крайней мере три белка: RF3, EF-G и RRF . У эукариот белка, аналогичного структурно или функционально белку RRF, до сих пор не найдено, поиски ведутся уже давно. Роль eEF-2, эукариотического гомолога фактора EF-G прокариот, на посттерминальной стадии белкового синтеза пока изучена недостаточно.
Было высказано предположение, что eRF3 в функциональном смысле является суммой активностей RF3 и RRF прокариот [ Buckingham, ea 1997 ]. В пользу такой гипотезы можно привести несколько аргументов, хотя все они косвенные:
а) молекулярная масса eRF3 (67,8 кДа) примерно соответствует сумме молекулярных масс RRF и RF3;
б) eRF3 кодируется геном, существенным для жизни клетки [ Kushnirov, ea 1988], как и RRF;
в) в полном геноме дрожжей [ Goffeau, ea 1996 ] не удалось найти гена, которому можно было бы приписать функцию кодирования эукариотического RRF;
г) для освобождения рибосом от факторов и тРНК после терминации необходим гидролиз GTP; для функции eRF3 также необходимо расщепление GTP, так как негидролизуемый аналог GTP неактивен [ Zhouravleva. ea 1995 ].
Кроме изложенной гипотезы [ Buckingham, ea 1997 ], которую можно условно выразить как eRF3 = RF3 + RRF, существуют по крайней мере еще три другие гипотезы.
Предполагают [ Ito, ea 1996 , Nakamura, ea 1996 , Stansfield, ea 1995 ], что eRF3 может быть функционально подобен прокариотическому фактору EF-Tu или его эукариотическому гомологу eEF1alfa. Это предположение исходит из следующих данных:
а) оба белка GТРазы;
б) оба белка кодированы генами, существенными для жизни клетки;
в) оба белка имеют определенную структурную гомологию на сравнительно протяженных участках своих полипептидных цепей [Kushnirov, ea 1988];
г) если eRF1 можно уподобить тРНК ( табл. 1 ) в функциональном отношении, то между ними может быть и пространственное сходство [ Ito, ea 1996 ].
Как известно, тРНК в аминоацилированной форме связывается с EF-Tu в присутствии GTP. По аналогии eRF1 связывается с eRF3-GTP; по этой логике, если eRF1 подобен тРНК, то eRF3 подобен EF-Tu (или eEF-1alfa).
Легко заметить, что все аргументы носят косвенный характер и не основаны на изучении функций eRF3 как таковых.
Существуют серьезные возражения против изложенной гипотезы. Самое прямое из них состоит в том, что eRF1 катализирует гидролиз пептидил-тРНК без eRF3 и GTP, тогда как хорошо известно, что аминоацил-тРНК не связывается достаточно прочно с А-участком рибосомы в отсутствие GTP и EF-Tu. Далее, прокариотический аналог eRF3-RF3 обладает свойствами, прямо противоположными ожидаемым для молекулы, подобной EF- Tu: он ускоряет не ассоциацию RFl/2-факторов с рибосомой, а, наоборот, диссоциацию RFl/2-рибосомного комплекса [ Freistroffer, ea 1997 ], что полностью противоречит EF-Tu-подобной модели. Показано как in vivo [ Le ea 1997 ], так и in vitro [ Drugeon, ea 1997 ], что eRFl конкурирует с супрессорными тРНК за терминирующие кодоны в А- участке рибосомы без видимого участия eRF3 и GTP. Это означает, что сродство eRF1 к рибосоме достаточно высоко в отличие от аминоацил-тРНК и нет необходимости в усилении связывания с помощью eRF3, как это происходит в случае EF-Tu и аминоацил-тРНК. Согласно EF-Tu-подобной модели для eRF3 на С-конце молекулы eRF1 должен находиться участок, сильно обогащенный дикарбоновыми аминокислотами, который должен связываться с eRF3, имитируя полинуклеотидную цепь тРНК, несущую отрицательные заряды фосфатных остатков [ Ito, ea 1996 ]. Однако наши экспериментальные данные говорят о том, что С-концевой участок связывания eRF1 с eRF3 такого блока аминокислот, несущих отрицательный заряд, не содержит. Другое предсказание модели [ Ito, ea 1996 ] также противоречит нашим экспериментальным данным: eRF1 не взаимодействует в комплексе с N-концевым пептидом eRF3.
Сопоставляя аргументы pro и contra, явно следует отдать предпочтение вторым.
Другая гипотеза уподобляет eRF3 фактору транслокации EF-G (или eEF-2) [ Nissen, ea 1995 ) и рассматривает терминацию как акт, подобный элонгации по своему механизму. В этом случае, если, условно говоря, eRF1 = тРНК, то для транслокации "последней" тРНК, т.е. eRF1, нужен фактор транслокации, как это требуется при всех актах элонгации. Если верна EF-G-модель, eRF3 должен перемещать eRF1 (аналог аа-тРНК) из А-участка или из А/Р- состояния (по модели Ноллера [ Moazed, ea 1989 ]) в Р-участок (или в Р/Е-состояние), однако транслокацию eRF1, предсказываемую этой моделью, пока экспериментально не наблюдали. У прокариот RF3 вызывает диссоциацию RF1/2 [ Freistroffer, ea 1997 ], хотя прямо не показано, с какого участка рибосомы происходит диссоциация, и неизвестно, предшествует ли диссоциации транслокация.
Имеющиеся данные об eRF3 не противоречат EF-G-модели, однако прямые аргументы в ее пользу также пока отсутствуют.
Клетка должна располагать мощным и надежным механизмом, предотвращающим некорректное "чтение" терминирующего или значащих кодонов. Обычно такие механизмы называют корректировкой (proofreading), аналогично исправлению ошибок при корректуре версток статей. Проблема корректировки многократно обсуждалась в литературе применительно к этапам элонгации и аминоацилирования тРНК [ Yarus, ea 1992 , Yarus, ea 1992 ].
Применительно к терминации эта проблема не привлекала пока серьезного внимания. Не исключено. что eRF3 может оказаться той молекулой, которая играет в этом процессе важную роль [ Frolova. ea 1996 ].
Корректировка требует затрат энергии на исправление ошибки и обычно этим источником служит свободная энергия гидролиза GTP. eRF3 также может утилизировать энергию распада GTP в этих же целях.
Таким образом, третья гипотеза приписывает eRF3 роль корректора. Пока eRF3 - единственный известный белок, участвующий в функционировании эукариотических рибосом на посттерминальных стадиях. Поскольку посттерминальный этап белкового синтеза изучен у эукариот совершенно недостаточно, вполне возможно, что кроме eRF3 на этих стадиях участвуют еще неидентифицированные белки. В последнее время появляются данные, которые указывают на такую возможность, по крайней мере в случае дрожжей [ Weng, ea 1998 , Czaplinski, ea 1998 ]. В системе in vitro гидролиз пептидил-тРНК под действием eRF1 и гидролиз GTP под действием eRF3-eRF1-комплекса в рибосоме могут быть полностью разобщены [ Frolova. ea 1996 ]. Более того, гидролиз пептидил-тРНК может быть отделен от стадии диссоциации рибосом и мРНК [ Cao. ea 1998 ]: при трансляции открытой рамки считывания РНК цитомегаловнруса человека описана ситуация, когда длительное время гидролиз пептидил-тРНК блокируется (т.е. не происходит терминации), однако рибосомы оказываются способными освободиться от такой мРНК без гидролиза пептидил-тРНК.
В совокупности приведенные данные означают, что стадии терминации и освобождения рибосомы от мРНК, тРНК и факторов ( recycling ) - разные этапы трансляции и осуществляются они с помощью разных факторов и механизмов, которые можно при определенных условиях разобщить. Сейчас стало очевидным, что eRF1, взаимодействуя с терминирующим кодоном и, возможно, с его 3'-соседями [ Tate. ea 1996 , [Poole, ea ], катализирует гидролиз пептидил- тРНК, т.е. терминацию как таковую, тогда как eRF3 потенциально может осуществлять корректировку (тогда он корректор терминации) и (или) быть мотором процесса освобождения рибосомы, способствуя транслокации или диссоциации других компонентов комплекса, в первую очередь eRF1 и деацилированной тРНК.
