UPR у млекопитающих
После идентификации компонентов UPR у дрожжей с удвоенной силой стал осуществляться поиск аналогичных механизмов у млекопитающих. В 1998 в лабораториях Kaufman и Ron были независимо обнаружены два различных гомолога Ire1 у млекопитающих, которые были названы Ire1-альфа и Ire1-бета ( Wang ea., 1998 ; Tirasophon ea., 1998 ). Оба белка обнаруживают высокую степень гомологии друг с другом и с дрожжевой Ire1p-киназой, включая эндонуклеазный домен. Ire1альфа экспрессируется повсеместно, тогда как Ire1бета экспрессируется преимущественно лишь в клетках эпителия кишечника . Сверхэкспрессии любого из этих белков в ряде различных клеточных линий достаточно для up-регуляции шаперонов ЭР. Для этого необходима активность киназы, а также активность эндорибонуклеазы, поскольку сверхэкспрессия мутантных киназы и РНКазы ингибирует индукцию UPR. В лаборатории Kaufman продемонстрировали, что иммунопреципитированный экзогенно экспрессирующийся Ire1альфа может расщеплять мРНК HAC1 дрожжей in vitro, подтверждая, что эндонуклеазный домен функционален. В отдельных исследованиях лаборатории Ron показано, что ЭР-стресс индуцирует олигомеризацию и фосфорилирование эндогенного Ire1альфа ( Kaufman, 1999 ). Несмотря на эти открытия, гомологов HAC1 в других организмах не обнаружено, и ни один из транскрипционных факторов, связывающихся с промоторами ЭР-шаперонов, вероятно, не процессируются подобно мРНК HAC1. Хотя некоторые данные свидетельствуют о том, что мРНК Ire1альфа и рибосомальная 28S-РНК могут быть мишенями эндорибонуклеазной активности Ire1альфа, оставалось неясным, какую роль эти эффекты могли бы играть в индукции downstream-компонентов ответа на ЭР-стресс у млекопитающих. Еще более озадачивающим было открытие того, что, хотя Ire1альфа и является важным для эмбрионального развития мыши, MEF как IRE1альфа-, так и IRE1бета- - мышей обнаруживали нормальный ответ на ЭР-стресс.
Вскоре после открытия двух белков Ire1 в лабораториях Ron и Wek независимо обнаружили третью локализованную в ЭР стресс-индуцируемую киназу у млекопитающих, которую они назвали PERK и PEK, соответственно ( Harding ea., 1999 ; Kaufman, 1999 ). Эта киназа обнаруживает некоторую гомологию со стрессочувствительным доменом Ire1 , но не обладает эндонуклеазным доменом и не присутствует у дрожжей. PERK/PEK - член семейства киназ eIF2альфа , активируемых в ответ на различные клеточные стрессы . Фосфорилирование eIF2альфа предотвращает сборку рибосомных инициаторных комплексов 80S и служит для ингибирования трансляции белка в течение ЭР-стресса. В отличие от Ire1-нокаутов, прерывание механизма сигнала PERK у PERK- -мышей или у мышей, несущих гомозиготную мутацию по eIF-2альфа (S51-A), которые не могут быть фосфорилированы PERK, выражается в глубоких изменениях механизма ЭР-стрессового сигнала ( Harding ea., 2001 ; Scheuner ea., 2001 ). У мутантов обоих типов наблюдаются серьезные нарушения метаболизма глюкозы ; они также особенно чувствительны к апоптозу, индуцируемому ЭР-стрессом , благодаря их неспособности ограничивать накопление несвернутых белков. В дополнение к этому, клетки этих животных не могут индуцировать транскрипционный фактор CHOP (еще одну мишень механизма UPR) и обнаруживают низкий уровень индукции шаперонов ЭР.
В дополнение к этому в лаборатории Mori в промоторах шаперонов ЭР была обнаружена консервативная последовательность (длиной 19 нп) ERSE (CCAAT-9-CCACG), реагирующая на ЭР-стресс (Yoshida и др., 1998). Будучи отличной от UPRE дрожжей, ERSE млекопитающих была, тем не менее, обнаружена также у беспозвоночных, растений и грибов. Используя ERSE из промотора человеческого гена GRP78 для одногибридного скрининга у дрожжей, они клонировали два гена ( Yoshida ea., 1998 ): ATF6 , bZIP- транскрипционный фактор, идентифицированный ранее лабораторией Prywes, и XBP-1 , белок, связывающийся с X-боксом . Хотя ATF6 обладает некоторой гомологией с Hac1p в области основной лейциновой молнии и, подобно HAC1, ATF6 конститутивно экспрессируется, мРНК ATF6 не претерпевает подобной реакции расщепления. Вместо этого ATF6 синтезируется как локализованный в ЭР трансмембранный белок с мембранным "стрессочувствительным" доменом и цитоплазматическим доменом, активирующим транскрипцию. При ЭР-стрессе трансактивационный домен ATF6 выщепляется из мембраны ЭР и транспортируется в ядро , где он связывается с ERSE ( Yoshida ea., 1998 ; Kaufman, 1999 ).
В лабораториях Brown и Goldstein было покаазано, что этот процесс зависит от локализованных в комплексе Гольджи протеиназ S1P и S2P , которые также расщепляют локализованный в ЭР белок, связывающийся со стерол-респонсивным элементом ( SREBP ), в ответ на изменения уровня холестерола в мембране . Таким образом, оказалось, что ATF6 заполняет нишу отсутствующего у млекопитающих транскрипционного фактора Hac1p, но не активируется путем, для которого необходима активность Ire1. Возможно, ATF6 и PERK являются ответственными за большую часть трансдуцирующей активности UPR; вероятно, они не являются указанием на последствия Ire1-зависимого сигнала, необходимого для UPR млекопитающих.
Это повлекло за собою запутанный вопрос о том, почему такой уникальный бифункциональный фермент не только был сохранен, но, собственно, дуплицирован в процессе эволюции.
