Иммуногистохимический анализ в ветеринарных лабораториях
Иммуногистохимический анализ применяется для исследования слабо различимых новообразований. Это важный метод типирования опухоли, и его применение позволило лучше понять дифференциацию клеток. Иммуногистохимический анализ также позволяет точно установить гистогенез новообразования, которое не поддается дифференциации на базе морфологического исследования. Чаще всего в диагностической патологии пробу фиксируют в формалиновом растворе, обрабатывают парафиновым воском, делают срезы и устанавливают на предметном стекле. Несомненно, такая система продолжает наиболее часто применяться для клинических проб из-за необходимости быстрой постановки диагноза, основываясь на гистоморфологических критериях. Однако при иммуногистохимическом анализе важная проблема заключается в том, что процедуры, необходимые для получения парафинового блока и обработки фрагментов тканей на предметном стекле, часто оказывают вредное воздействие на интересующие врача компоненты ткани. В результате отрицательной иммуногистохимической реакции может произойти потеря, диффузия, уменьшение, химическое изменение и маскировка антигена.
Другим фактором, способным оказывать влияние на результаты иммуногистохимического окрашивания в лаборатории, является хранение неокрашенной пробы на предметном стекле. В исследовании, проведенном при раке груди у людей, пробы держали в формалине, заливали парафином, а затем производили иммуноокрашивание на выявление p53-антигена; при этом интенсивность окраски заметно уменьшалась, если неокрашенное предметное стекло хранили при комнатной температуре. Через две недели интенсивность окраски уменьшалась на 31% по сравнению с началом исследования, через 4 недели она составляла лишь 18% от первоначальной нормы, а по прошествии 12 недель некоторые случаи, которые первоначально считались положительными, были отнесены к отрицательным. Хранение неокрашенных тканей на предметном стекле при 4*С не предотвращает потерю антигена, хотя уменьшение иммунореактивности не происходит с такой же быстротой, как у проб, которые хранились при комнатной температуре.
Потеря интенсивности окраски также отмечалась для антигена фактора VIII и эстрогенного рецептора на предметных стеклах, которые хранились при комнатной температуре. У проб, хранившихся в формалиновом фиксирующем растворе, залитых парафином, при комнатной температуре не наблюдалось потери антигенности. Несмотря на то, что потеря антигена, связанная с хранением проб, обычно не является проблемой для клинических проб, с которыми лабораторные исследования проводятся в течение нескольких дней после сбора, полученные результаты показывают, что предметные стекла, предназначенные для иммуногистохимического исследования, не должны предварительно разрезаться и храниться, а следует готовить заново из первоначальных парафиновых блоков для любых процедур, которые производятся позже, чем через несколько дней.
Обработка тканей. Ткани для иммуногистохимических процедур нужно готовить быстро путем замораживания или других методов фиксации для сохранения антигенов тканей без аутолизиса тканей. Ткани могут оставаться без фиксации в течение 6-24 часов с небольшим ухудшением, если их подготовить соответствующим образом после иссечения. Для кратковременного хранения свежие ткани нужно завернуть в марлю, смоченную в физиологическом растворе, и заморозить при 4*С (не замораживая в лед) до перевоза в лабораторию. Нужно всегда использовать физиологический раствор для сохранения изотонии раствора. При использовании водопроводной воды может иметь место клеточный артефакт. Для замораживания следует отрезать характерный участок ткани, а для фиксации и обычного морфологического исследования нужно отрезать тканевую пробу. В табл. 1(vv15) представлены методы быстрого замораживания тканевых проб для иммуногистохимических исследований.
Срезы криостата замороженных тканей дают наилучшую возможность демонстрации широкого спектра антигенов. Замороженные срезы нужны для всестороннего анализа гемопоэтических опухолей , поскольку многие антигены дифференциации поверхности лейкоцитов часто бывают денатурированы даже после кратковременного контакта с формальдегидом. В дальнейшем многие маркеры клеточного типа, такие как десмин , кератины и виментин , также наблюдаются больше в опухолевых клетках в замороженных срезах, чем в тканях, фиксированных формальдегидом. Для проведения многих вновь созданных иммуногистохимических методов для факторов роста или их рецепторов и для онкоген-закодированных протеинов часто требуются замороженные срезы. С другой стороны, в продаже появляется все больше и больше антител для тканей, фиксированных в формалине. Более того, некоторые маркеры требуют фиксации формальдегидом, и их нельзя продемонстрировать на замороженных срезах, фиксированных ацетоном или спиртом, потому что они растворимы в этих фиксирующих растворах и вымываются ими. Среди них такие антигены, как S-100 протеин , нейрон-специфическая енолаза и альфа-антитрипсин . Длительность фиксации в формальдегиде также может повлиять на результаты иммуногистохимического анализа; например, продолжительная фиксация пробы в формальдегиде будет препятствовать иммуногистохимическому окрашиванию пролиферирующего антигена ядерных клеток (PCNA) . Иногда для сохранения некоторых антигенов фиксация в спиртовом растворе может быть лучше, чем в формальдегиде; например, антигенность промежуточных волокон сохраняется при фиксации этанолом и метанолом, в том числе их модификациями (фиксатор Карноя). Преимуществами данного метода над замороженными срезами являются его удобство и лучшая морфологическая сохранность.
Несмотря на то, что антигенность многих эпитопов пропадает или уменьшается после фиксации в формалине, некоторые антигены лишь прячутся за стуруктурирующей природой фиксации формальдегидом и могут выделяться при микроволновой или протеолитической ферментной обработке пищи; наиболее часто используются такие ферменты, как трипсин , проназа и пепсин . Из-за различий в фиксации различных частей пробы оптимальное иммуноокрашивание часто достигается лишь в части пробы, придавая ей пестрый, неоднородный рисунок иммунного окрашивания. При рассмотрении результатов иммуногистохимического анализа методы восстановления антигенов дают дополнительную информацию к размышлению. Восстановление антигенов приводит к увеличению реактивности целевого антигена в результате понижения порога обнаружения для иммунной реактивности. Это может сыграть важную роль при исследовании онкогена или генных протеинов, подавляющих опухоль, таких как c-erbB2 или р53 , при наблюдении закрашенного предметного стекла полуколичественным методом в качестве показателя генной экспресии.
