Исследование оперона микроцина C: штаммы, среды и плазмиды
В большинстве экспериментов, если не указано иное, использовались клетки штамма BW25113 [ Datsenko, 2000 ]. Для оценки количества микроцина в супернатанте клеток-продуцентов использовался газон чувствительного штамма E. coli BL21(DE3). Для проверки активности промотора перед геном галактокиназы использовался штамм HB101 (ATCC33694), в геноме которого отсутствует функциональный ген galK . Если не указано иное, клетки выращивали на среде LB (1% бактотриптона, 0.5% дрожжевого экстракта, 1% NaCl) с добавлением агара до 1.2% при приготовлении агаризованной среды.
Плазмида pp70 - производная от pBR322 и содержит фрагмент ДНК длиной 6000 п.о., содержащий кластер микроциновых генов mcc. Для создания pp70 BstXI-ApaLI фрагмент микроциновой плазмиды pBM43 [ Kurepina, 1993 ] и EcoRI-AvaI фрагмент вектора pBAD ( LifeTechnologies ), лигировали по тупым концам.
Производные pp70, содержащие мутации в старт-кодоне mccA ATG1->TAA или последовательности Шайн-Дальгарно (SD, ATAGGAGG->CCCTACTT), а также плазмида pp70-51 с делецией в межгенном участке между mccA и mccB нуклеотидов с +59 по +109 (относительно старта транскрипции mcc ) были получены при помощи методов сайт-специфического мутагенеза pp70.
Для получения серии плазмид для поиска промоторов на основе pFD51 перед репортерным геном галактокиназы galK вставляли один из десяти 600-нуклеотидных фрагментов mcc оперона в прямой или обратной ориентации. Для этого линеаризованную по сайту EcoRV плазмиду pFD51 лигировали по тупым концам с ПЦР фрагментом mcc оперона.
Для получения плазмид pFD51_mcc_dir и pFD51_mcc_inv гибридизовали два комплементарных олигонуклеотида, чтобы получить фрагмент двуцепочечной ДНК, содержащий терминаторную шпильку mcc, а также 7 выше- и 13 нижележа-щих нуклеотидов. Олигонуклеотиды подбирали таким образом, чтобы на 5'-конце после отжига образовался сайт AvaI, а на 3' - EcoRV. Полученный фрагмент лигировали с AvaI-EcoRV фрагментом плазмиды pFD100 [ Beletskaya, 2000 ], между сильным конститутивным промотором lacUV5 и репортерным геном galK.
Для детекции экспрессии galK in vivo использовали клетки штамма HB101 (ATCC33694), в геноме которых отсутствует ген galK. Эти клетки трансформировали pFD плазмидами и рассевали трансформанты штрихом на селективную среду МакКонки (Difco) с 1%-ой галактозой и выращивали при 37*C в течение ночи.
Матрицы для in vitro транскрипции получали методом ПЦР с использованием плазмидной матрицы pp70 в случае E. coli либо путем отжига двух комплементарных олигонуклеотидов, содержащих T7 A1 промотор и начальный участок mcc оперона в случае mcc оперонов других организмов.
