Короткие РНК и эпигеномный сайленсинг
Исследования роли siPHK и белка Dicer в подавлении экспрессии на уровне хроматина были начаты на модельных объектах - растениях ( Arabidopsis thaliana ) и делящихся дрожжах ( Schizosaccharomyces pombe ), а затем продолжены и на дрозофиле [ Matzke, 2005 , Wassenegger, 2005 ].
У растений РНК-сайленсинг, опосредованный siPHK , сопровождается репрессорными модификациями гистонов и метилированием ДНК и вызывается эндогенной дцРНК, идентичной по нуклеотидной последовательности промоторам генов [ Wassenegger, 2005 ]. Источником дцРНК является транскрипция самокомплементарных обращенных повторов или РНК-зависимый синтез РНК.
У дрожжей siPHK участвуют в гетерохроматинизации прицентромерных областей хромосом. В этом случае дцРНК образуются благодаря транскрипции обеих нитей ДНК повторов этих районов или, как и у растений, с помощью РНК-зависимой РНК-полимеразы. дцРНК процессируется при участии белка Dicer с образованием siPHK, которые связываются белком Argonaute (AGO) , необходимым для их взаимодействия с насцентными транскриптами ( рис. 1 ). Образующийся комплекс привлекает гистонметилтрансферазу, обеспечивающую введение репрессорной модификации НЗК9mе (см. " Модификация гистонов хроматина и прогрессия опухоли ") и ассоциацию гетерохроматинового белка - гомолога НР1 у дрожжей. Это приводит к гетерохроматинизации и сайленсингу центромер, что необходимо для когезии хроматид и их нормального расхождения при делении клетки [ Zaratiegui, 2007 , Buhler, 2007 ]. Метилирование ДНК у дрожжей отсутствует.
Следовательно, выдвигается на первый взгляд парадоксальное, но доказываемое экспериментально предположение, что для формирования компактного неактивного хроматина необходима транскрипция хроматина, поскольку насцентные транскрипты являются платформой для сборки комплексов, осуществляющих сайленсинг. У растений для формирования гетерохроматина требуется транскрипция соответствующих областей хромосомы, осуществляемая особой РНК-полимеразой IV [ Кленов, 2005 , Wassenegger, 2005 ].
Таким образом, гетерохроматинизация определяется транскрипцией, и сложившиеся представления о том, что гетерохроматин не транскрибируется, должны быть подвергнуты существенной корректировке.
Происхождение siPHK из дцРНК в клетках млекопитающих, не обладающих РНК-зависимой РНК-полимеразой, можно объяснить двунаправленной транскрипцией повторяющихся элементов генома - гетерохроматиновых повторов и мобильных элементов. Кроме того, некодирующие межгенные участки генома млекопитающих также транскрибируются, причем образующиеся транскрипты могут быть противоположно направленными и комплементарными друг другу [ Willingham, 2006 , Ravasi, 2006 , Chen, 2004 ]. Наконец, образование особого типа коротких РНК из однонитевых транскриптов также не исключено.
Исследования, проведенные на культурах клеток человека, в основном опухолевого происхождения, показали, что введенная в клетки дцРНК или экспрессируемая в клетках siPHK может осуществлять транскрипционный сайленсинг, если ее мишенью служит комплементарная ей последовательность промотора гена [ Ting, 2005 , Morris, 2004 , Han, 2007 , Weinberg, 2006 , Janowski, 2006 , Castanotto, 2005 ]. Для сайленсинга необходима транскрипция промоторной области [ Han, 2007 , Weinberg, 2006 ], как было показано на модельных объектах [ Matzke, 2005 , Wassenegger, 2005 ]. Однако нельзя исключить, что мишенью может служить и ДНК промотора.
Транскрипционный сайленсинг характеризовался появлением репрессорных модификаций (НЗК27mеЗ и НЗК9mе2) гистонов и сопровождался [ Morris K.V. et al. 2004 ] или не сопровождался [ Ting, 2005 , Weinberg, 2006 ] метилированием гена-мишени.
В клетках HeLa экспрессия siPHK , комплементарной району промотора и островков CpG опухолевого супрессора RASSF1A (Ras association domain family 1 isoform A), приводила к сайленсингу гена вследствие метилирования ДНК , причем заметных репрессорных модификаций гистонов не была обнаружено [ Castanotto, 2005 ]. Однако в другой работе транскрипционный сайленсинг гена rassf1a , зависимый от siPHK, сопровождался введением в гистоны промотора модификации НЗК9mе2 и ассоциацией на промоторе белка AGO1 комплексом PcG , привлекающего ДНК-метилтрансферазу [ Kim, 2006 ]. С помощью дцРНК, комплементарных промоторным районам гена рецептора прогестерона, удавалось подавить его экспрессию в клетках рака молочной железы, что, однако, не сопровождалось заметным изменением в модификации гистонов [ Janowski, 2006 ]. В этом случае ингибирование экспрессии белков семейства Argonaute (AGO1 и AGO2) снимало как сайленсинг, вызываемый siPHK, комплементарной промотору, так и siPHK, мишенью которой является цитоплазматическая мРНК. Эти данные указывают на пересечение путей транскрипционного саиленсинга и механизмов РНКи , реализующихся на уровне трансляции.
Результаты цитируемых работ демонстрируют сходство зависимых от siPHK механизмов сиквенсспецифичного транскрипционного сайленсинга у человека и модельных объектов. Приведенные примеры транскрипционного сайленсинга, обнаруженного на культурах клеток опухолей, отражают интерес исследователей к разработке новых подходов к "эпигеномной терапии" канцерогенеза, которая обещает оказаться высокоспецифичной. Однако нельзя также не отметить сообщение о случае парадоксальной активации экспрессии гена рецептора прогестерона, вызванной siPHK, комплементарной промоторной последовательности и сопровождающейся появлением в мишени активных гистоновых модификаций [ Janowski, 2007 ].
Роль системы РНКи обнаруживается не только на примере сайленсинга опухолевых супрессоров или протоонкогенов, но и в поддержании гетерохроматиновой структуры центромерных областей в клетках млекопитающих [ Fukagawa, 2004 , Kanellopoulou, 2005 ]. Транскрипция обеих нитей ДНК центромерных областей может приводить к образованию дцРНК, которая при участии эндонуклеазы Dicer процессируется с образованием siРНК [ Hutvagner, 2002 ]. Нокаут гена Dicer в эмбриональных стволовых клетках мышей приводил к нарушениям эпигеномного сайленсинга центромерных повторов - снижалось метилирование ДНК и исчезали характерные репрессорные модификации гистонов [ Kanellopoulou, 2005 ]. В культуре клеток, обладающих гибридным геномом (хромосома 21 человека на фоне куриного генома), делеция гена Dicer приводила к накоплению ненормальных митозов, демонстрирующих преждевременное разъединение сестринских хроматид [ Fukagawa, 2004 ]. Исследования на дрозофиле также показывают, что нарушение экспрессии белка семейства Argonaute (AGO2) может приводить к декомпактизации центромерного гетерохроматина и нарушению динамики клеточных делений [ Deshpande, 2005 ], а мутации в гене белка Dicer сопровождаются дезорганизацией центромерного гетерохроматина [ Peng, 2007 ].
Все эти результаты позволяют обоснованно предполагать участие коротких РНК в поддержании гетерохроматиновых структур в клетках человека, дефекты которых характерны для опухолевых клеток.
