p53 белок: Трансактивационные свойства p53
Анализ аминокислотной последовательности р53 позволил предположить, что р53 может выступать в качестве транскрипционного фактора . Эта возможность была подтверждена в экспериментах с использованием fusion-белка между разными фрагментами р53 и ДНК-связывающим доменом дрожжевого транскрипционного фактора Gal4 . Трансактивационный домен был картирован в N-конце молекулы р53, однако остальные части р53 могли оказывать влияние на его трансактивационные свойства. ( Fields, Jang, 1990 ; Raycroft et al., 1990 ).
К трансактивационному домену р53 принадлежат примерно первые 70 аминокислот ( Under et al., 1992 ; Miller et al., 1992 ; Fields et al., 1990 ).
Комплекс РНК-полимеразы II состоит из собственно фермента и ряда транскрипционных факторов: TFIID , TFIIA , TFIIB , TFIIE , TFIIF , TFIIH и TFIIJ . TFIID представляет собой ДНК-связывающий комплекс, составной частью которого является собственно ТАТА-связывающий белок ( TBP , от англ. TATA-binding protein ) и ТВР-ассоциированные факторы ( TAFs , от англ. TBP-associated factors ).
р53 взаимодействует с транскрипционным мультисубъединичным комплексом TFIID и непосредственно с белком ТВР ( Seto et al., 1992 ).
В связывание р53 с ТВР вовлечен с 20 по 57 аминокислотный остаток N-конца, а также 75 аминокислотных остатка С-конца белка р53 и участок с 220 по 271 аминокислотный остаток белка ТВР ( Horikoshi et al., 1995 ; Liu et al., 1993 ).
р53 взаимодействует с TAF 31 человека, который является гомологом TAF 40 дрозофилы . р53 и TAF 31 могут образовывать комплекс in vitro и коиммунопреципитируются моноклональными антителами к р53 ( Lu et al., 1995 ). Мутации по 14/19 и 22/23 аминокислотным остаткам нарушают взаимодействие р53 и TAF 31 в растворе. Именно эти двойные мутации значительно уменьшают способность белка р53 регулировать транскрипцию in vitro и in vivo, не влияя на способность р53 специфически связываться с ДНК и не изменяя конформацию белка р53. Использование поликлональных антител к TAF 31 в TFIID комплексе блокирует способность р53 стимулировать транскрипцию in vitro. Базальный уровень транскрипции TFIID в этом случае не изменялся ( Lu et al., 1995 ).
Новым этапом в изучении транскрипционных свойств р53 явилось открытие класса последовательностей, с которыми р53 способен специфически связываться ( Funk 1992 , El-Deiry, 1993 ). р53 активирует транскрипцию репортерных генов ( САТ , бета-gal , люциферазы ), находящихся под конторолем промоторов, содержащих р53-респонсивные элементы из Funk et al., 1992 ) в различных типах клеток.
По-видимому, С-концевой домен не требуется для трансактивационной способности р53. По крайней мере, делеционный мутант по С-концу (содержащий первые 338 аминокислот) и не способный олигомеризоваться.
трансактивировал промотор, содержащий р53-элемент в клетках Saos2 (-/- по р53).
Трансактивация, осуществляемая р53, негативно регулируется белком mdm2 ( Momand et al., 1992 ). Белок MDM2 связывается с р53 только дикого типа и для этого взаимодействия важны 14/19 и 22/23 аминокислотные остатки. mdm2 связывается с трансактивационным доменом р53 и это взаимодействие, по- видимому, не позволяет р53 взаимодействовать с транскрипционным аппаратом РНК-полимеразы II, что приводит к подавлению трансактивации.
Белки ДНК-содержащих онкогенных вирусов также влияют на транскрипционную активность р53, хотя механизм действия их может быть различным. Так, белок Е6 вируса папиломы усиливает скорость деградации р53. Большой Т-антиген вируса SV40 связывается с ДНК- связывающим доменом р53 , возможно препятствуя взаимодействию р53 с ДНК. Аденовирусный белок Е1В 55К может связываться с р53 и подавлять трансактивирующую функцию р53, хотя механизм этого процесса не ясен ( Yew et al., 1992 ).
Одним из самых интересных вопросов в изучении транскрипционной активности р53 является роль мутантных форм белка в регуляции транскрипции. Так мутант 273H, по-видимому, сохранивший часть активностей р53 дикого типа, способен активировать промотор, содержащий 12 копий р53-респонсивного элемента RE, но в меньшей степени, чем дикий. Мутанты р53 по положениям 143A, 175H, 248W, 273H и 281G, так же как и р53 дикого типа, активируют промотор гена рецептора эпидермального фактора роста ( EGFR , от англ. epidermal growth factor receptor ) в клетках Saos-2 (с делецией гена р53) ( Deb et al., 1994 ). Промоторная область гена EGFR не содержит консенсуса связывания р53, однако, там расположено несколько полусайтов.
Экспрессия мутантых р53 ингибирует трансактивацию промоторов (одно из проявлений доминантно-негативных свойств мутантов). Однако, ингибирование транскрипционных способностей р53 дикого типа зависит как от типа клеток, так и от вида мутанта. Так, например, в линии клеток аденокарциномы легкого или остеосаркомы трансактивация р53 нарушалась экспресией мутантов р53. С другой стороны, в клетках гепатокарциномы , инфицированных HBV , и карциномы яичников коэкспрессия р53 дикого типа и мутантов His273 (или Trp248) усиливала трансактивацию ( Forrester et al., 1994 ). Механизм ингибирования трансактивационных свойств р53 мутантами неизвестен. Наиболее распространенным объяснением является следующее. При одновременной экспрессии дикого и мутантного р53 образуется гетероолигомеры дикого и мутантного белка и доминирующей формой является мутант. Однако нельзя исключить, как возможный механизм, конкуренцию за белковые факторы и связывание с ДНК.
Были обнаружены несколько промоторов, специфически регулируемых мутантными р53. Так, мутанты р53 активировали экспрессию гена САТ , находящегося под контролем фрагмента 1800 н. из промоторной области гена множественной лекарственной устойчивости ( mdr1 ), в системе эмбриональных Один из механизмов, с помощью которых р53 может влиять на пролиферацию клетки - транскрипционная активация и репрессия генов-мишеней , продукты которых вовлечены в регуляцию жизнедеятельности клетки ( Levine, 1993 ). р53 является уникальным транскрипционным фактором , который активирует промоторы, содержащие р53-респонсивные элементы RE, и супрессирует широкий класс промоторов, не содержащих такие элементы. По-видимому, активирущие и супрессирующии функции локализованы в разных участках р53 и не связаны между собой, хотя точечные мутации приводят к утрате обеих этих активностей.
