Рецепторы эпидермального фактора роста (EGFR)

Карта белка рецептора фактора роста эпидермального

Основной источник: Н.Е. Кушлинский , 2000

Программированная гибель клетки может начинаться не только с прямого воздействия канцерогена на ДНК. В частности, УФ-излучением и алкилирующими агентами наряду с повреждением ДНК активируются рецепторы эпидермального фактора роста. Последние помимо активации сигнальных путей, таких как ras-MAPK , PI3K , SAPK или STAT , индуцируют ДНК-независимый ответ на повреждение, активирующий MAР-киназный путь , приводящий к апоптозу [ Roos, 2006 ].

Рецептор EGF был найден во многих тканях взрослого организма. Число рецепторов EGF варьирует от одного клеточного типа к другому. Наибольшее число рецепторов выявлено в эмбриональной ткани и пролиферирующих клетках эпителия .

Рецептор имеет молекулярную массу 170000 и состоит из длинного внеклеточного домена с двумя богатыми цистеином областями, трансмембранного домена и внутриклеточного домена, обладающего тирозинкиназной активностью ( Downward J. et al., 1984 ). Эта активность рецептора EGF важна для осуществления большинства его функций, включая изменение подвижности клеток и инициацию синтеза ДНК ( Schlessinger J., 1988 ).

EGF, связываясь с рецепторами, вызывает их агрегацию с последующей интернализацией комплексов EGF-рецептор в составе окаймленных пузырьков . Рецепторы EGF связывают не только EGF, но и трансформирующий фактор роста (, который является ведущим стимулятором клеточной пролиферации в опухолях и, возможно, при заживлении ран  (рис 2-3).

Рецептор ЭФР, крупный трансмембранный гликопротеин с мол. массой 170000 дальтон, является продуктом одного из онкогенов семейства erb - c-erbB1, относится к числу рецепторных тирозинкиназ (РТК), важных регуляторов клеточной пролиферации и злокачественной трансформации, принципиальной особенностью которых является трансмембранная локализация и необходимость во взаимодействии с соответствующим полипептидным лигандом для реализации киназной активности.

Молекула РЭФР, как и молекулы всех рецепторных тирозинкиназ, состоит из 3-х основных доменов: внеклеточного N-концевого гликолизированного лиганд-связывающего участка, составляющего около 50% всей молекулы (621 из 1173 аминокислотных остатков) и обеспечивающего специфичность восприятия сигнала; собственно трансмембранного a-спирального участка, состоящего всего из 23 гидрофобных аминокислот, и внутриклеточного тирозинкиназного домена (542 аминокислоты), наиболее консервативного участка.

Благодаря исследованиям последних лет структура РЭФР описана весьма детально, и в каждом из главных доменов теперь также выделяются различные функционально важные участки. Так, в лиганд-связывающем домене выделяют 2 цистеин-богатых участка, стабилизирующих вторичную структуру домена, и 2 глобулярных, богатых глицином, фрагмента, которые и ответственны, по-видимому, за узнавание специфических лигандов. Непосредственно к трансмембранной спирали с внутриклеточной стороны примыкает небольшой, так называемый околомембранный регуляторный фрагмент, затем следуют собственно киназный, АТФ-связывающий участок, еще один "шарнирный" (hinge) регуляторный фрагмент и, наконец, аутофосфорилируемый С-концевой субдомен. В регуляторных фрагментах находятся остатки треонина и серина, которые могут фосфорилироваться внутриклеточными протеинкиназами, такими как протеинкиназа С (ПКС) или митоген-активируемая протеинкиназа (МАП киназа) или киназа МАП киназы.

Предполагается, что фосфорилирование Тре654 в околомембранном фрагменте под действием ПКС и, возможно, некоторых других протеинкиназ аллостерически регулирует сродство рецептора к лиганду и активность киназного домена, а фосфорилирование Тре669 и Сер671, а также нескольких сериновых остатков в "шарнирном" участке МАП киназой регулирует скорость ЭФР-зависимой интернализации рецептора. В С-концевом участке молекулы РЭФР находится по крайней мере 4 остатка тирозина (Тир1068, Тир1086, Тир1148 и Тир1173), которые аутофосфорилируются внутренней РТК. Именно эти фрагменты молекулы РЭФР распознаются эффекторными или адаптерными белками и обеспечивают передачу регуляторных сигналов и реализацию эффектов факторов роста.

Оба основных функциональных участка молекулы РЭФР могут стать мишенью действия соответствующих блокаторов. Взаимодействие связывающего участка с лигандом может быть подавлено неспецифическими (типа сурамина) и специфическими (в первую очередь, моноклональными антителами к рецептору) агентами, а активность тирозинкиназы - различными ингибиторами, которых в настоящее время разработано уже много, и некоторые из которых достаточно специфичны для тирозинкиназы РЭФР. Установлено также, что моноклональные антитела к РЭФР подавляют рост опухолей только в том случае, если происходит торможение аутофосфорилирования РЭФР.

Связывающий участок РЭФР может быть мишенью и еще для одного класса противоопухолевых препаратов - гибридных белков, содержащих конъюгаты факторов роста и бактериальных токсинов или других цито-токсических агентов. В данном случае, РЭФР выступает уже в качестве направленного переносчика токсического агента в опухолевую клетку.

Известно, что некоторые мутации в молекуле РЭФР приводят к стабилизации его димерного состояния, постоянной активации тирозинкиназы в отсутствии лиганда или к ингибированию процесса интернализации рецепторов. Все они способствуют сохранению трансформированного фенотипа и делают клетку устойчивой к действию агентов, подавляющих связывание лиганда с рецептором. В опухолях с такими мутантными рецепторами, наряду с ингибиторами тирозинкиназы, важную роль приобретают и препараты, блокирующие последующие этапы реализации митогенных сигналов факторов роста.

Важнейшие внутриклеточные сигнальные системы, в регуляции которых участвует РЭФР, - это метаболизм фосфатидилинозитола и система гена ras, включающая целый каскад митоген-активируемых протеинкиназ.

Метаболизм фосфатидилинозитола (PI) - это один из первых процессов, для которых было доказано регуляторное действие ЭФР-рецепторной системы. Этот фосфолипид, составляющий относительно небольшую фракцию липидов клеточной мембраны, является тем не менее важным вторичным мессенджером и играет центральную роль во многих внутриклеточных сигнальных системах. Действие ЭФР на клетки, содержащие соответствующие рецепторы, вызывает быстрое увеличение скорости обмена фосфоинозитидов. Наиболее существенной частью сложного метаболизма фосфоинозитола  является фосфорилирование и дефосфорилирование различных участков инозитольного кольца, а ключевой реакцией, в регуляции которой участвует активированный ЭФР-рецепторный комплекс, является превращение одного из промежуточных продуктов метаболизма PI - PI-4,5-бифосфата (PIР2) - под действием фосфолипазы С (ФЛС) в инозитол-1,4,5-трифосфат (IР3) и диацилглицерол (ДАГ). Каждое из этих веществ само по себе служит важным вторичным мессенджером: IР3 мобилизует свободный внутриклеточный Са2+, а ДАГ активирует протеинкиназу С - ключевой фермент регуляции пролиферации, транскрипции, промоции опухолей. ПКС в свою очередь активирует фосфолипазу D, стимулируя тем самым гидролиз другого важного фосфолипида - фосфатидилхолина.

Участие ЭФР в регуляции этих процессов осуществляется, по-видимому, в результате того, что активированный РЭФР связывает и затем фосфорилирует одну из форм ФЛС - ФЛСy-1, переводя ее в активное состояние. Активированный РЭФР связывает и, возможно, фосфорилирует также еще ряд ферментов метаболизма фосфоинозитола - киназы PI 3, PI 4 и PIР 5. При этом если роль двух последних ферментов достаточно очевидна и заключается в осуществлении последовательного превращения PI -> PIР -> PIР2 с образованием субстрата ФЛС, то значение активации PI 3, превращающей PI, PIР и PIР2 в соответствующие производные, содержащие фосфатную группу в положении D3 инозитольного кольца и не гидролизуемые ни одной из форм ФЛС, остается пока не вполне ясным. Исследования последних лет показали, однако, что активация PI 3 киназы, происходящая непосредственно под действием фосфорилированного РЭФР, является пусковым механизмом, обеспечивающим ras-независимую стимуляцию некоторых важных регуляторных киназ, таких как pp70 S6, Akt/Rac, а также ras-зависимую стимуляцию JNK-киназы.

Другой важнейшей системой, регулируемой с участием активированного РЭФР, является система гена ras. Продукт гена ras, белок р21ras, представляет собой регуляторный трансмембранный G белок (белок, связывающий гуаниновые нуклеотиды). Так же, как другие G белки, р21ras активен в ГТФ-связанном состоянии и неактивен в ГДФ-связанной форме. G белки участвуют в передаче внеклеточных регуляторных сигналов гормонов, факторов роста, нейромедиаторов к системе внутриклеточных вторичных мессенджеров. Непосредственной мишенью действия активированного р21ras является внутриклеточная серин-треониновая протеинкиназа raf (белок р74c-raf), гомологичная белкам семейства РКС. Raf-киназа, в свою очередь, активирует целый каскад внутриклеточных киназ МАП киназ и собственно МАП киназ. В результате этой активации происходит фосфорилирование протоонкогена с-jun, являющегося транскрипционным фактором, и индукция транскрипции онкогенов с-fos, c-myc и других генов, инициирующих митоз. Raf-киназа может также непосредственно фосфорилировать и, соответственно, активировать находящийся в цитоплазме неактивный c-myc, в результате чего он возвращается в ядро и связывается со специфическими участками хроматина, инициируя экспрессию с-fos, с-jun и с-ras.

Таким образом, можно более или менее детально представить процесс передачи регуляторного сигнала ЭФР (и др. лигандов РЭФР) от клеточной мембраны к ядру.

Дальнейшие исследования показали, что активированные РТК оказывают влияние на ras не непосредственно, а через сложную цепь адаптерных и эффекторных белков. С одной стороны, молекула rasGAP содержит аминокислотную последовательность SH2 (src homology 2) - белковый домен размером около 100 аминокислот, наличие которого, по-видимому, является отличительным признаком всех субстратов РТК, так как именно они узнают фосфорилированные последовательности активированных РТК (SH2 домены присутствуют, в частности, в структуре ФЛС*, PI 3 киназы и других субстратов РТК. Таким образом, rasGAP может непосредственно фосфорилироваться киназой РЭФР. С другой стороны, расшифрована цепочка молекул, передающих активирующий сигнал от РТК к факторам обмена нуклеотидов, в частности, к белку, получившему название SOS из-за своей гомологии с регуляторным белком дрозофилы "son of sevenless". Непосредственным переносчиком сигнала от фосфорилированного рецептора к SOS служит так называемый белок GRB2 (Growth Factor Receptor Bound 2), имеющий в своем составе как один узнаваемый РТК SH2 домен, так и два домена SH3 (src homology 3) - небольшие последовательности примерно из 50 аминокислот, способные узнавать богатые пролином участки в некоторых белковых молекулах. В передаче сигнала может участвовать также еще один небольшой белок (small connector protein - shc; 42 - 66 kDa), который содержит SH2, но не SH3 домен, фосфорилируется РЭФР и взаимодействует с GRB2.

По последним данным, путь РЭФР- shc - GRB2 - SOS более важен для активации ras, чем прямое взаимодействие РЭФР с GRB2. Показано также, что весь процесс активации ras происходит на клеточной мембране, куда транслоцируются соответствующие белки после аутофосфорилирования РЭФР, в результате чего регуляторный белок SOS оказывается в непосредственной близости от эффекторного белка р21ras. В связи с этим важную роль в процессе передачи митогенного сигнала ЭФР через систему ras играет реакция фарнезилирования белка р21ras - присоединения к его С-концевому участку специфического липидного фрагмента, обеспечивающего прикрепление этого белка к клеточной мембране. С-фарнезилирование, обеспечивающее прикрепление белка к мембране, важно также и для активации PI-3-киназы. В этой связи ингибиторы фарнезилирования считаются в настоящее время одним из перспективных новых классов противоопухолевых агентов.

Hsuan предложил теоретическую схему, согласно которой могут взаимодействовать между собой два главных пути передачи митогенных сигналов факторов роста (активация обмена фосфатидилинозитола и активация системы ras). Представленная им модель предполагает возможность образования на клеточной мембране вокруг активированной РТК (в частности, РЭФР) олигомолекулярного комплекса высокого порядка, включающего всю совокупность РТК-регулируемых киназ, адаптерных и эффекторных молекул и обеспечивающего передачу регуляторных сигналов и взаимодействие между различными внутриклеточными сигнальными системами. Некоторые теоретические предположения уже нашли свое подтверждение в экспериментальных исследованиях.

Hsuan предложил теоретическую схему, согласно которой могут взаимодействовать между собой два главных пути передачи митогенных сигналов факторов роста (активация обмена фосфатидилинозитола и активация системы ras). Представленная им модель предполагает возможность образования на клеточной мембране вокруг активированной РТК (в частности, РЭФР) олигомолекулярного комплекса высокого порядка, включающего всю совокупность РТК-регулируемых киназ, адаптерных и эффекторных молекул и обеспечивающего передачу регуляторных сигналов и взаимодействие между различными внутриклеточными сигнальными системами. Некоторые теоретические предположения уже нашли свое подтверждение в экспериментальных исследованиях.

Описанная выше достаточно сложная схема механизма действия факторов роста, опосредуемого их специфическими рецепторами, является тем не менее достаточно упрощенной и не охватывает всех возможных эффектов активированных РТК, которые могут включать взаимодействие с белками цитоскелета, регуляцию активности протеинфосфатаз, а также прямое фосфорилирование транскрипционных факторов. Кроме того, эта схема предполагает наличие только мембранно-цитоплазматических эффектов, однако в последнее время появились исследования, свидетельствующие о том, что ЭФР-рецепторные комплексы могут также транслоцироваться в ядро клетки.

Ссылки:

Все ссылки