RNAi и сборка гетерохроматина у S. pombe

Хромосомы S. pombe содержат в центромерах и "молчащих" локусах типа спаривания ( mat2 / mat3 ) обширные участки гетерохроматиновой ДНК, ассоциированные с лежащими в их основе повторяющимися элементами ДНК ( Grewal, 2000 ; Pidoux and Allshire, 2004 ). Каждая центромера дробянковых дрожжей содержит уникальный центральный коровый район ( cnt ), который фланкируется повторами двух типов, называемыми самыми внутренними ( inr - innermost) и самыми внешними ( otr - outermost) повторами ( рис. 8.2 ). Район otr сам состоит из повторов dh и dg .

Формирование гетерохроматина у S. pombe включает совместное действие ряда trans-действующих факторов. Сюда входят деацетилазы гистонов ( HDACs ), Clr4 , метилтрансфераза лизина 9 гистона НЗ ( НКМТ ) и белки, связывающиеся с НЗК9-метилом гистона, Swi6 (гомолог НР1 ) и Chp1 . Предполагается, что первоначальное рекрутирование Swi6 и Chp1 к хроматину приводит к распространению метилирования НЗК9 и формированию гетерохроматина через последовательные циклы катализируемого Clr4 метилирования НЗК9, сопряженного с опосредуемым Swi6 распространением на соседние нуклеосомы через его самоассоциацию ( Grewal and Moazed, 2003 ).

Мутация в компонентах пути RNAi приводит, как это ни удивительно, к утрате центромерного гетерохроматина и накоплению некодирующих "прямых" и "реверсных" транскриптов с двунаправленных промоторов в пределах каждого повтора dg и dh ( рис. 8.2 ) ( Volpe et al., 2002 ). У дробянковых дрожжей есть единственный ген для каждого из белков RNAi, Dicer , Argonaute и RdRP ( dcr1+ , ago1+ и rdp1+ , соответственно). Удаление любого из этих генов приводит к утрате метилирования НЗК9 гистонов , и мутанты обнаруживают дефекты в расхождении хромосом, которые обычно связаны с дефектами в сборке гетерохроматина ( Provost et al., 2002 ; Volpe et al., 2003 ). Более того, секвенирование библиотеки малых РНК дробянковых дрожжей выявило РНК длиной приблизительно 22 нуклеотида , которые картировались исключительно в районах центромерных повторов и повторов рибосомной ДНК, позволяя предполагать, что эти РНК могут образовывать dsRNAs, которые процессируются в siRNA ( Reinhart and Bartel, 2002 ). Таким образом, было высказано предположение, что путь RNAi может рекрутировать Swi6 и Сlr4 к хроматину для того, чтобы инициировать и (или) поддерживать формирование гетерохроматина в каждом из вышеуказанных локусов ( рис. 8.3 ) ( Hall et al., 2002 ; Volpe et al., 2002 ).

Интересно, что и механизм TGS , и мехнизм PTGS , по-видимому, вносят вклад в даун-регуляцию сеn-РНК.

Транскрипт с "прямой" нити в основном сайленсирован на транскрипционном уровне, как это видно на мутантах по RNAi ( Volpe et al., 2002 ). Однако "обратная" нить транскриптов сеn не затрагивается мутантами Swi6 ( Volpe et al., 2002 ), и сайленсинг этого "обратного" сеn-транскрипта происходит главным образом на посттранскрипционном уровне.

RNAi играет также роль в сайленсировании локуса типа спаривания (mat2/3) ( Hall et al., 2002 ). mat2/3 прерывается участком ДНК, который в высокой степени гомологичен центромерным повторам (называется cenH - cenHomology) ( рис. 8.2 ). Подобно повторам сеn , район сеnН транскрибируется дивергентно, образуя "прямые" и "обратные" РНК ( Noma et al., 2004 ). Эти транскрипты сеnН у мутантов по RNAi накапливаются до высоких уровней. Напротив, RNAi не является необходимой для сайленсинга репортерного трансгена, вставленного в mat2/3, если сайленсинг не был сначала как-то нарушен. Причина этого различия в том, что частично избыточный механизм сайленсинга, включающий два связывающихся с ДНК белка, Per1 и Atf1 , которые связываются с mat2/3, рекрутирует гетерохроматиновую машинерию независимо от RNAi ( Jia et al., 2004 ). Этого достаточно для сайленсирования репортерного гена в отсутствие RNAi, но недостаточно для предотвращения накопления некодирующих транскриптов сеnН ( рис. 8.2 ).

Ссылки: