Притяжение белков, связывающихся с метил-CpG
Второй способ репрессии противоположен первому, поскольку он связан с белками, которые притягиваются, а не отталкиваются метил-CpG ( рис. 18.5 и табл. 18.2 ). Этот способ репрессии вначале был обнаружен в экстрактах из клеток млекопитающих, которые были способны поддерживать транскрипцию добавленных генов. Добавление следовых количеств ДНК- матрицы сделало возможной транскрипцию с неметилированных репортерных генов, тогда как метилированные репортеры были репрессированы ( Boyes and Bird, 1991 ). Увеличение количества добавляемой ДНК вызывало транскрипцию метилированных и неметилированных матриц на эквивалентных уровнях, что заставляло предполагать, что лимитирующие количества транскрипционного ингибитора, специфичного к метилированию ДНК, раститровывались [were being titrated out]. В соответствии с этой интерпретацией находящаяся в избытке метилированная неспецифическая конкурентная ДНК [excess methylated nonspecific competitor DNA] снимала репрессию метилированных генов в этих экстрактах. Доказательства непрямого подавления транскрипции также поступили из опытов, в которых метилированная ДНК, введенная в клетки млекопитающих и ооциты лягушки, сделала возможной транскрипцию генов только в начале ( Buschhausen et al., 1987 ; Kass et al., 1997 ). Сайленсинг происходил несколькими часами позже, заставляя предполагать, что сайленсинг может зависеть от сборки хроматина. Для того чтобы обнаружить белки, которые могли бы специфически связываться с метилированными генами и обусловливать наблюдаемую репрессию, были применен метод задержки в электрофорезном геле [bandshift assay] с использованием случайных метилированных последовательностей ДНК в качестве зондов. Комплекс ДНК-белок, специфичный к метилированной ДНК ( MeCP1 ), наблюдали в ряде клеточных типов у млекопитающих ( Meehan et al., 1989 ). Индивидуальный связывающийся с метил-CpG белок, МеСР2 , был, однако, первым белком, подлежащим очистке и клонированию. Белки с мотивами связывания с ДНК, родственными мотивам МеСР2, были идентифицированы в результате поисков в базах данных и обозначены как семейство метил-СрG-связывающих доменов , охватывающее МеСР2 , MBD1 , MBD2 , MBD3 и MBD4 ( табл. 18.2 ) ( Bird and Wolffe, 1999 ). Один из этих белков (MBD2) является связывающимся с ДНК компонентом комплекса MeCP1 (см. выше).
Из белков MBD три - МBD1 , МВD2 и MeCP2 - участвуют, как предположили, в зависимой от метилирования репрессии транскрипции ( Bird and Wolffe, 1999 ). Как было показано, неродственный белок, Kaiso , тоже связывается с метилированной ДНК и осуществляет зависящую от метилирования репрессию в модельных системах ( табл. 18.2 ) ( Prokhortchouk et al., 2001 ; Yoon et al., 2003 ). Понимание механизма репрессии пришло вместе с осознанием, что МеСР2 связывается корепрессорным комплексом mSin3a и зависит в своем действии от деацетилирования гистонов ( Jones et al., 1998 ; Nan et al., 1998 ). Это открытие показало, что метилирование ДНК может "считываться" МеСР2 и служить сигналом к изменению структуры хроматина ( рис. 18.6 ). С тех пор было показано, что каждый из этих четырех связывающихся с метил-CpG белков ассоциирован с отдельным корепрессорным комплексом. Особый интерес представляет MBD1 , который связывается с метилтрансферазой лизина гистонов, SETDB1 , лишь в ходе репликации ДНК ( Sarraf and Stancheva, 2004 ). Продолжающееся метилирование НЗК9 гистонов в последовательностях-"мишенях" хромосомной MBD1 и стабильный сайленсинг ассоциированных генов зависят от периодического рекрутирования этой активности, модифицирующей хроматин.
Знание сайтов-"мишеней" MBD в геноме является предпосылкой для понимания его биологической роли. Можно было бы ожидать, что они конкурируют друг с другом за доступ к метилированным сайтам в силу их перекрывающейся специфичности нуклеотидной последовательности ДНК. Удивительно, что связывающиеся с MBD сайты в геноме в основном не перекрывались, когда их исследовали, используя клетки первичной клеточной линии человека; это позволяет предполагать, что каждый белок, связвающийся с метил-CpG, становится "мишенью" независимым образом ( Klose et al., 2005 ). Это соответствует появляющимся данным, показывающим, что связывание MBD обнаруживает специфичность к нуклеотидной последовательности ДНК ( табл. 18.2 ). Например, МеСР2 обнаруживает сильное предпочтение к сайтам mCpG, которые фланкируются цепочкой ДНК, обогащенной AT ( Klose et al., 2005 ). Более того, MBD1 обладает дополнительным связывающимся с ДНК доменом, специфичным к неметилированным CpG, a Kaiso узнает пару соседних мотивов mCpG ( Prokhortchouk et al., 2001 ). Пока что лишь MBD2, по-видимому, обладает эксклюзивным сродством к mCpG.
