8-Оксигуанин мутагенные свойства
Мутагенный потенциал 8-oxoGua исследован в экспериментах нескольких типов. Изучались, во-первых, кинетические параметры включения эукариотическими и бактериальными ДНК-полимеразами различных dNMP напротив 8-oxodGMP в ДНК-матрице in vitro и, во-вторых, частота и спектр мутаций, возникающих в плазмидной ДНК на месте находящегося в определенной позиции остатка 8-oxoGua при трансформации ей бактериальных или эукариотических клеток. Аналогично для исследования промутагенных свойств 8-oxodGTP анализировалась кинетика его включения ДНК- полимеразами in vitro и возникающие в плазмидной ДНК мутации после синтеза в присутствии 8-oxodGTP и селекции в клетках.
Исследование включения канонических dNMP разными ДНК-полимеразами напротив 8-oxoGua в ДНК-матрице показывает, что, как и следовало ожидать из вышеупомянутых физико-химических свойств 8-oxodGuo , он может вызывать включение не только dCMP, но и dAMP. Как правило, репликативные ДНК-полимеразы ( ДНК-полимераза-a и ДНК-полимеразыа-дельта эукариот, ДНК-полимераза бактериофага T7 , ДНК-полимераза Taq и ДНК-полимераза Tte , обратная транскриптаза HIV-1 ) в значительной степени блокируются 8-oxoGua и преимущественно включают dAMP, тем самым создавая предмутагенный гетеродуплекс 8-oxoGua:Ade, в то время как репаративные ДНК-полимеразы ( ДНК-полимераза-b эукариот, ДНК-полимераза I E.coli , фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I E.coli и Bacillus stearothermophilus) преимущественно включают dCMP, хотя относительная эффективность включения dCMP и dAMP по литературным источникам может значительно варьировать [ Kamiya, ea 2003 ]. Даже при наличии у ДНК-полимеразы корректирующей 3-5-экзонуклеазной активности, после включения dCMP и dAMP напротив 8-oxoGua такие пары не воспринимаются как ошибочные [ Shibutani, ea 1993 ]. Однако скорость включения следующего dNMP часто бывает ниже, чем в случае канонических пар, причем для пары Ade:8-oxoGua она обычно выше, чем для Cyt:8-oxoGua [ Lowe, ea 1996 ]. Относительная эффективность включения dCMP и dAMP также зависит от последовательности, окружающей поврежденное основание: полипиримидиновые тракты способствуют включению dAMP [ Hatahet, ea 1998 ]. Транслезионные ДНК-полимеразы ( ДНК-полимераза II , ДНК-полимераза IV и ДНК-полимераза V бактерий, ДНК-полимераза зета , ДНК-полимераза эта , ДНК-полимераза иота , ДНК-полимераза каппа , ДНК-полимераза лямбда , ДНК-полимераза мю , ДНК-полимераза ню , ДНК-полимераза тета , эукариот), функция которых заключается в синтезе участка ДНК длиной в один или несколько dNMP при наличии поврежденных звеньев в матрице и невозможности их репарации [ Prakash, ea 2005 ], также включают dCMP или dAMP напротив 8-oxoGua. При этом тоже наблюдается значительная вариабельность относительной эффективности включения. Наиболее эффективный синтез при наличии 8-oxoGua в ДНК- матрице обеспечивается при совместном действии транслезионных и репликативных полимераз, хотя частота предмутагенного включения dAMP при этом довольно велика. Значительное повышение эффективности и точности синтеза при наличии 8-oxoGua эукариотическими ДНК-полимеразами также достигается за счет их взамодействия со вспомогательными белковыми факторами репликации, прежде всего RPA и PCNA [ Maga, ea 2007 ]. В то время как при включении dNMP с образованием канонических пар скорость реакции обычно лимитируется предкаталитическим конформационным изменением в молекуле ДНК-полимеразы, скорости включения dAMP напротив 8-oxoGua или включения следующего по ходу синтеза dNMP обычно лимитируются каталитической стадией, что свидетельствует о неоптимальной конформации активного центра ДНК-полимеразы в момент катализа [ Lowe, ea 1996 ].
Структуры некоторых ДНК-полимераз в комплексе с 8-oxoGua-содержащей ДНК и включаемым dNTP, определенные методом РСА (рентгеноструктурного анализа) и дополнительно исследованные методами молекулярной динамики, показывают, что подгонка звена 8-oxodGuo в активном центре фермента требует некоторого изменения конформации остова ДНК, но в целом геометрия пар dCyd:8-oxodGuo и dAdo:8-oxodGuo напоминает канонические уотсон-криковские пары и не позволяет ферменту воспринимать их как ошибочные [ Brieba, ea 2004 ]. При использовании ДНК-полимеразами 8-oxodGTP в качестве субстрата также происходит включение 8-oxodGMP в основном напротив Cyt и Ade в матрице [ Kamath-Loeb, ea 1997 ].
Интересно, что присутствие 8-oxoGua в ДНК-матрице может влиять на эффективность и точность включения dNMP в позиции, соседние с поврежденной (эффект " дистанционного мутагенеза ") [ Miller, ea 1997 ].
Степень мутагенности 8-oxoGua in vivo сильно различается у бактерий и эукариот. В плазмидных конструкциях, трансфицированных в E. coli, частота мутагенеза находится на уровне 0,1-1%, а в клетках млекопитающих 2-24% [ Kamiya, ea 2003 ].
В полном соответствии со специфичностью включения dNMP ДНК-полимеразами в подавляющем большинстве случаев мутации, вызванные 8-oxoGua, представляют собой трансверсии G-T . Однако иногда в ходе репликации мутации возникают и в положениях, соседних с остатком 8-oxoGua [ Kamiya, ea 1992 ], что подтверждает возможность дистанционного мутагенеза in vivo. Мутагенез, индуцированный 8-oxoGua, может быть одним из шагов на пути к перерождению клетки в опухолевую: например, трансфекция клеток млекопитающих в культуре плазмидами, содержащими остаток 8-oxoGua в кодоне 12 ("горячей точке" активации) протоонкогена c-Ha-ras, приводит к увеличению числа фокусов трансформации [ Kamiya, ea 1992 ].
РНК-полимеразы обычно слабо блокируются 8-oxoGua в ДНК-матрице и эффективно включают напротив него CMP и AMP, что служит причиной т.н. транскрипционного мутагенеза - синтеза с поврежденных ДНК-матриц РНК и полипептидов с последовательностью, отличной от последовательности кодирующей цепи ДНК [ Chen, ea 1993 ]. Помимо этого, наличие 8-oxoGua вблизи промоторных участков снижает скорость перехода РНК-полимеразы в фазу элонгации транскрипции [ Viswanathan, ea 1998 ]. Как и для ДНК-полимераз, синтез при наличии поврежденного дезоксинуклеотида эукариотической РНК-полимеразой II также облегчается некоторыми факторами транскрипции, однако сравнительная эффективность корректного и ошибочного включения NMP при этом не исследована [ Larsen, ea 2004 ].
