Цианобактерии: азотфиксация
Азотфиксирующая активность выявлена более чем у 250 штаммов, принадлежащих к разным группам фототрофных эубактерий . Примерно половину из них составляют цианобактерии. Способность последних к фиксации N2, определяемая по наличию нитрогеназной активности, зависит от условий и, в первую очередь, от содержания в среде связанного азота и молекулярного кислорода. Основное место действия обоих факторов - нитрогеназа. В первом случае источники связанного азота репрессируют синтез и ингибируют активность фермента, во втором - О2 быстро инактивирует его.
Отрицательное действие О2 на азотфиксацию связано с восстановительной природой процесса. Возникшая первоначально у анаэробных прокариот, получающих энергию за счет брожения, способность к азотфиксации проявилась и в группах эубактерий с бескислородным фотосинтезом . Благоприятные условия для нее обеспечивались анаэробным типом метаболизма этих групп. И только цианобактерии столкнулись с проблемой функционирования в клетке двух процессов, один из которых имеет восстановительную природу, а другой сопровождается выделением такого сильного окислителя, как О2. Возникла необходимость защиты или изолирования процесса азотфиксации от молекулярного кислорода.
Вегетативные клетки многих изученных культур обнаруживают нитрогеназную активность в анаэробных и микроаэробных условиях. Только для единичных культур, например представителей рода Gloeothece , показана способность вегетативных клеток к азотфиксации в аэробных условиях, при этом до 95% фиксированного азота приходится на темновой период, т.е. процессы фотосинтеза и азотфиксации разделены во времени. В целом же проблема фиксации N2 в аэробных условиях значительной частью цианобактерий решена путем формирования дифференцированных клеток определенного типа - гетероцист , в которых чувствительный к О2 аппарат фиксации молекулярного азота отделен от фотосинтетического аппарата с помощью определенных ультраструктурных и биохимических перестроек. Таким образом, способность подавляющего большинства цианобактерий к азотфиксации в аэробных условиях связана с гетероцистами.
При отсутствии в среде связанного азота некоторые вегетативные клетки (обычно 5-10%) нитчатых цианобактерий, принадлежащих к порядкам Nostocales и Stigonematales , превращаются в гетероцисты, образование которых происходит в течение 24 ч параллельно с развитием нитрогеназной активности и может быть разделено на два этапа. Прогетероцисты, формирующиеся на первом этапе, характеризуются неспособностью обеспечить защиту нитрогеназы от инактивирующего действия О2, а также тем, что процесс дифференцировки на этой стадии обратим. На втором этапе процесс дифференцировки становится необратимым. Сформированные гетероцисты не способны к делению и не могут превращаться в вегетативные клетки.
Формирование гетероцист из вегетативных клеток сопровождается глубокими ультраструктурными и функциональными перестройками ( рис. 86 , А). Зрелые гетероцисты окружены тремя дополнительными слоями, внешними по отношению к клеточной стенке, что затрудняет проницаемость в них воды, ионов, нейтральных веществ гидрофильной природы и растворенных газов. Дополнительные слои, окружающие гетероцисту, в местах ее контакта с вегетативной клеткой прерываются. Перегородка, отделяющая гетероцисту от вегетативной клетки, пронизана множеством мелких каналов (микроплазмодесм), соединяющих цитоплазмы обеих клеток и обеспечивающих обмен клеточными метаболитами. В цитоплазме гетероцист в зонах контакта с вегетативными клетками располагаются светопреломляющие полярные гранулы цианофицина.
Значительную реорганизацию претерпевает в гетероцистах система фотосинтетических мембран: они укорачиваются, теряют расположение, характерное для вегетативных клеток; как правило, отмечается скопление тилакоидов вблизи полюсов гетероцисты. Морфологические изменения тилакоидов сочетаются с важными перестройками фотосинтетического аппарата на функциональном уровне. В гетероцистах не работает фотосистема II . Следовательно, внутриклеточный О2 в них не образуется. Потеря активности II фотосистемы коррелирует со следующими биохимическими особенностями гетероцист: отсутствием основных светособирающих пигментов II фотосистемы - фикобилипротеинов и содержащих их структур - фикобилисом ; резко пониженным содержанием ионов марганца - необходимого компонента системы разложения воды; потерей гетероцистами способности фиксировать СО2, связанной с отсутствием рибулозодифосфаткарбоксилазы в растворимой форме или в виде карбоксисом . Деградация II фотосистемы сопровождается сохранением активности I фотосистемы , что находит отражение в поддержании значительного уровня хлорофилла a и увеличении числа реакционных центров этой фотосистемы.
В процессе формирования гетероцист наблюдается исчезновение различных цитоплазматических включений, характерных для вегетативных клеток: гликогеновых, полифосфатных гранул. В то же время в гетероцистах сохраняется в полном объеме генетическая информация, и в процессе их жизнедеятельности отмечаются активные процессы синтеза РНК и белка. На генетическую полноценность гетероцист указывают и неоднократно наблюдавшиеся факты их прорастания и деления.
Для фиксации N2 необходим восстановитель в виде молекул восстановленного ферредоксина (иногда НАДФ*Н2 ) и химическая энергия в форме АТФ. Из-за отсутствия в гетероцистах нециклического транспорта электронов они не могут обеспечивать процесс азотфиксации фотохимически образованным восстановителем и зависят в этом отношении от межклеточного переноса метаболитов ( рис. 86 , Б). Восстановитель может или непосредственно транспортироваться из соседних вегетативных клеток в готовом виде, или же генерироваться в гетероцистах в темновых ферментативных процессах из исходного транспортируемого субстрата. В последнем случае таким субстратом служит дисахарид мальтоза - продукт восстановительного пентозофосфатного цикла . Ее катаболизирование, осуществляемое по активно функционирующему в гетероцистах окислительному пентозофосфатному пути , приводит к образованию молекул НАДФ*Н2 , с которых водород может передаваться на ферредоксин в реакции, катализируемой ферредоксин: НАДФ- оксидоредуктазой. Источником АТФ в гетероцистах на свету служит зависимое от I фотосистемы циклическое фотофосфорилирование, в темноте - окислительное фосфорилирование.
Нитрогеназная система катализирует восстановление N2 до аммония. Последний включается в молекулу глутаминовой кислоты в реакции, катализируемой глутаминсинтетазой ( рис. 111).В таком виде фиксированный азот транспортируется из гетероцист в вегетативные клетки, где с помощью глутаматсинтазы осуществляется перенос амидной группы на молекулу альфа-кетоглутарата: глутамин + альфа-кетоглутаровая кислота переходит в 2 молекулы глутаминовой кислоты. Одна из молекул глутамата возвращается в гетероцисту для очередного акцептирования NH4+, другая поступает в метаболизм вегетативной клетки.
Таким образом, все структурные и функциональные перестройки, происходящие в процессе формирования гетероцист, направлены на поддержание высокой активности нитрогеназы, что достигается, с одной стороны, путем эффективного ее снабжения восстановителем и энергией, с другой - защитой от молекулярного кислорода за счет уменьшения проникновения О2 через утолщенные оболочки гетероцист, реорганизации их фотосинтетического аппарата и высокой активности дыхания.
