Индуцированный мутагенез
Мутации , возникшие в результате действия химических или физических факторов, называются индуцированными мутациями. Известно два пути мутагенеза. Для мишенного мутагенеза характерны прямые взаимодействия мутагенных факторов с ДНК, ведущие к химической модификации оснований, к разрыву фосфодиэфирных связей и т.д. Второй, немишенный путь связан с химической модификацией пула нуклеотидов в клетке, модификацией ферментов репликации ДНК, снижающих их специфичность и т.д. (см.обзор: Drake, 1969 ).
Весьма распространенными физическим мутагенами являются рентгеновское и ультрафиолетовое излучение. Молекулярно-генетические исследования мутаций, индуцированных ультрафиолетом, у E.coli показали следующее (см. обзоры: Miller, 1985 ; Ауэрбах, 1978 ):
а) ультрафиолетовые лучи вызывают много типов мутаций. В гене lacI замены оснований составляют 60-65% всех мутаций, делеции одного или нескольких нуклеотидов - 35-40%;
б) сравнение мутационных спектров ультрафиолета с другими SOS-зависимыми мутагенами показало, что большинство мутаций, индуцированных ультрафиолетом, возникают из предмутационных повреждений;
в) для замен оснований характерно наличие транзиций и трансверсий , хотя самым распространенным переходом является G:C -> A:T трансверсия;
г) G:C -> A:T трансверсии выявляются в сайтах, образованных парами соседних пиримидинов. В одном случае переход сайта из AC в TC вызвал 15-ти кратное увеличение частоты C->T транзиций в этом сайте;
д)
65 122
1 AAATCCGGCTCCACAGCCACATTAACCATCACTGGGGTCCGAGCCGACGACAAT
2 CTCtccgTAtTcacaCAcacattaaccatcactggggtccAagccgaGgaTGaG
3 CTC TA T CA A G TG G
Рис. Пример выявления генной конверсии между V(l)-геном (1)и псевдогеном (2)
(Reynaud et al., 1987); внизу приведены возникшие соматические мутации(3).
Длина предполагаемого конверсионного тракта больше 58 нуклеотидов. для мутаций характерно большое влияние окружающей последовательности на частоту их возникновения
С одной стороны мишенями ультрафиолетового излучения являются пиримидиновые димеры (см. обзор: Miller, 1985 ), с другой стороны в работе ( Todd, Glickman, 1982 ) показана связь инвертированных повторов с "горячими" точками мутирования.
Другим классом мутагенов являются аналоги оснований. Фриз ( Freese, 1959 ) одним из первых применил 2-аминопурин как мутаген и предложил объяснение его мутагенного эффекта. Опыты с бактериофагами и бактериями показали, что аналог тимина 5-бромурацил и аналог пурина 2-аминопурин являются сильными мутагенами. 2-Аминопурин включается в ДНК вместо аденина и образует пары с тимином. При этом возможно ошибочное спаривание с цитозином в ходе репликации ДНК, уже включившей 2-аминопурин (ошибка репликации), а возможна ошибка при включении аналога в ДНК (ошибка включения) (Freese, 1959; Инге-Вечтомов, 1989 ). Авторы ( Coulondre et al., 1978 ) проанализировали "горячие" точки возникновения замен в гене lacI, индуцируемые 2-аминопурином.В трех выявленных "горячих" точках CAG кодон (исходная последовательность), который мутировал под воздействием 2-аминопурина в TAG (стоп-кодон), находился в составе последовательности CCAGG. Предполагается, что соседние основания могут влиять на частоту возникновения замен (Coulondre et al., 1978). В работе ( Sugino, Drake, 1984 ) исследовались мутации в гене rIIA, вызываемые 2-аминопурином. Показано, что замена A:T->T:A в позиции 250 вызвала изменение частоты возникновения мутаций в позиции 239, то есть на расстоянии 12 нуклеотидов (Sugino, Drake, 1984). Это является примером влияния удаленных нуклеотидов на частоту возникновения замен в определенном сайте.
Еще одним используемым аналогом оснований является O6-метилгуанин, который способен образовывать пары с тимидином в ходе репликации, вызывая A:T -> G:C замены. В работе ( Topal et al., 1986 ) исследовались мутации гена ампициллиназы фага-химеры f1/pbr322. Получена 151 мутация, распределенные по 81 потенциальной позиции мутирования (соответствующих аденинам) таким образом, что в 29 позициях с аденином мутации отсутствовали. Были проанализированы сайты, окружающие позиции, в которых мутации не наблюдались, и выявлен неслучайный консенсус :
5'...AG ACCAGGCT GT GCCA A AGG TAT G GCCTAGGTT ...3', позиция консенсуса, в которой мутации не наблюдались, отмечены пробелом с обеих сторон. Авторы (Topal et al., 1986) считают, что наличие этого консенсуса уменьшает частоту возникновения мутаций в центральной позиции этого консенсуса. Этот консенсус является примером контекста , который уменьшает частоту возникновения мутаций в определенных позициях последовательности.
К другим широко используемым мутагенам относятся бисульфит натрия, гидроксиламин, азотистая кислота, различные алкилирующие реагенты (т.е. реагенты, способные переносить алкильные группы на биологически важные макромолекулы) (см. обзоры: Drake, 1969 ; Ауэрбах, 1978 ; Singer, Kusmierek, 1982 ).
Интересные результаты получены в работе ( Burns et al., 1987 ) для алкилирующего мутагена N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидина. Для этого мутагена выявлено 167 мутаций G:C -> A:G в гене lacI E.coli. Такое большое количество мутаций позволило провести анализ влияния сайтов возникновения мутаций на частоту возникновения мутаций. Анализ выявил консенсус "горячих" точек: RG, где G - позиция мутирования. Авторы предположили, что такое влияние может объясняться рядом причин. Во-первых, соседнее основание может влиять на распределение О6-метилгуанина (мутагенного продукта N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидина) по последовательности, изменяя доступность О6 позиции гуанина. Во-вторых, соседнее основание может влиять на репарацию О6-метилгуанина метилтрансферазой. В-третьих, оно может влиять на точность процесса репликации ( Burns et al., 1987 ).
Таким образом, получено много данных о влиянии контекста на возникновение мутаций, индуцированных различными факторами.
