PBR (периферический бензодиазепиновый рецептор (ПБР, МБР)
Впервые ПБР были обнаружены при изучении связывания бензодиазепинов [ Braestrup ea 1977 ]. ПБР и центральные места связывания бензодиазепинов отличаются по характеристикам и структурным особенностям. В частности, центральный бензодиазепиновый рецептор содержит, в отличие от ПБР, функционирующий домен, связывающий ГАМКА [ Smith ea 1995 ].
Важной особенностью ПБР является их способность связывать как бензодиазепиновые, так и изохинолиновые производные . Рецептор представляет собой сложное образование: он включает субъединицу, связывающую изохинолины (молекулярная масса, м. м., 18 кДа), потенциалзависимый анионный канал ( VDAC , м. м. 32 кДа) и ПАН-переносчик адениновых нуклеотидов (ПАН, м.м. 30 кДа), причем VDAC локализован во внешней, а ПАН - во внутренней мембране митохондрий [ McEnery ea 1992 ]. Некоторые подробности структуры описаны в обзорах [ Gavish ea 1995 , Papadopoulos ea 1997 ]. Анализ распределения и количества в ткани (плотность) ПБР обычно ведется с помощью меченых синтетических производных бензодиазепина (наиболее часто применяемые - Ro 5-4864 , а также флунитразепам ) или производных изохинолина ( РК 11195 , РК 14105 ).
Для определения центральных бензодиазепиновых рецепторов чаще всего используют клоназепам , сродство которого к ПБР гораздо ниже; Ro 5-4864 слабо связывается с центральными рецепторами. Различия сродства позволяют относительно легко дифференцировать тип рецептора. Существуют бензодиазепины ( диазепам , Ro 5-2807 ), не обладающие избирательной аффиностью к рецепторам того или другого типа [ Amsterdam ea 1991 ].
В стероидогенных клетках ПБР локализованы в основном на наружной мембране митохондрий [ Papadopoulos ea 1994 ], хотя они обнаружены и в плазматической мембране [ Gamier ea 1993 , Оке ea 1992 ]. В ходе солюбилизации ПБР из митохондрий надпочечников при обработке дигитонином или тритоном Х-100 рецептор утрачивает способность связывать РК 11195 [ Anholt ea 1986 ]. Связывание изохинолинов с ПБР происходит за счет белка с молекулярной массой 18 кДа [ Gamier ea 1994 ]. Именно эта субъединица ПБР исследована наиболее подробно, и многие исследователи, характеризуя субъединицу 18 кДа, пишут о ПБР. Из клеток опухоли семенников мыши изолирована и секвенирована кДНК белка м. м. 18 кДа, имеющая 626 пар оснований [ Gamier ea 1994 ]. кДНК, содержащая 781 пару оснований и кодирующая белок м. м. 18 кДа из надпочечников крысы, получена еще в 1989 г. [ Sprengel ea 1989 ]. В последующем клонированы кДНК человека [ Riond ea 1991 ] и быка [ Parola ea 1991 ].
Экспрессия кДНК ПБР в фибробластах вызывала усиление связывания как изохинолинов, так и бензодназепинов [ Gamier ea 1994 ]. Однако если белок, кодируемый кДНК, встраивался в липосомы , то связывания бензодиазепинов не было, а только изохинолинов. Связывание бензодиазепинов восстанавливалось в липосомах при добавлении митохондриального экстракта, в котором присутствовал белок м.м. 34 кДа потенциалзависимый анионный канал [ Gamier ea 1994 ]. Наличие этого белка, очевидно, необходимо для связывания бензодиазепинов комплексом, включающим белки м. м. 18 и 30-35 кДа.
В митохондриях клеток МА-10 из лейдиговских клеток опухоли семенников мыши применение электронной микроскопии и антисыворотки к ПБР позволило обнаружить образование молекулярных кластеров, содержащих 4-6 молекул белка м. м. 18 кДа [ BoujradN., ea 1996 , Papadopoulos ea 1994 ].
Учитывая связь данного белка с канальным белком м. м. 34 кДа, авторы высказали следующие предположения:
1) митохондриальный ПБР - комплекс может функционировать в качестве поры, пропускающей холестерин и другие молекулы во внутреннее митохондриальное пространство;
2) нативный рецептор является мультимерным комплексом с м. м. ~140 кДа, построенным из 4-6 субъединиц м. м. 18 кДа, одной потенциалзависимой анионной канальной единицы м. м. 34 кДа и связанных липидов [ Papadopoulos ea 1994 ].
Создана пространственная трехмерная модель ПБР [ Bernassau ea 1993 ]. Пять трансмембранных доменов ПБР, представляющих собой а-спирали, пронизывают наружную бислойную фосфолипидную мембрану митохондрий [ Papadopoulos ea 1997 ]. На бактериальной культуре, трансфецированной ПБР, было исследовано значение разных участков молекулы белка м. м. 18 кДа, связывающего РК 11195 [ Culty ea 1999 , Li ea 1998 ]. Экспрессия мутантных форм ПБР в Е. coli показала, что делеция в цитоплазматическом С-концевом фрагменте молекулы резко снижает способность ПБР связывать холестерин, но не влияет на связывание РК 11195 [ Li ea 1998 ]. Направленный мутагенез позволил установить, что тирозин в 153-м положении и аргинин в 156-м принимают участие во взаимодействии ПБР и холестерина. Авторы постулировали существование последовательности аминокислот, определяющей узнавание холестерина и взаимодействие с ним: лейцин/валин - (Х),_5 - тирозин -(Х),_5 - аргинин/лизин [ Li ea 1998 ]. Эта последовательность показана во всех белках, взаимодействующих с холестерином. Таким образом, экспрессия ПБР обеспечивает возможность связывать и использовать после активации холестерин.
Разрушение гена ( нокаут гена 18 кДа субъединицы ПБР ) в клетках линии R2C из опухоли семенника крысы вызывает снижение стероидогенеза до 5% по сравнению с контрольными клетками [ Papadopoulos ea 1997a ]. Селекционированные клетки не содержали белка м. м. 18 кДа, а митохондрии, выделенные из этих клеток, не способны образовывать прегненолон из добавляемого холестерина [ Papadopoulos ea 1997a ]. Трансфекция селекционированных клеток кДНК ПБР восстанавливала их стероидогенную активность. Значение ПБР изучалось с использованием методологии "нокаута" посредством антисенс-РНК [ Kelly-Hershkovitz ea 1998 ]. В результате трансфекции клеток МА-10 этой системой происходила down- регуляция 18 кДа компонента ПБР. В итоге снижалась емкость связывания лигандов, но не изменялась аффинность, уменьшалось накопление прогестерона. Клетки реагировали на 8-Вr-цАМФ, но спектр стероидов при этом отличался от синтезирующихся соединений в контрольных клетках [ Kelly-Hershkovitz ea 1998 ]. Таким образом, применение различных подходов "нокаута" дало различные результаты, но они не противоречивы. В том случае, когда субъединица 18 кДа совершенно не экспрессировалась в клетках [ Papadopoulos ea 1997a ], по всей видимости, стероидогенез подавлялся почти полностью, но уменьшение экспрессии субъединицы 18 кДа оставляло возможность некоторой продукции стероидов [ Kelly-Hershkovitz ea 1998 ]. Ген человека, кодирующий ПБР , клонирован и исследован [ Lin ea 1993 ]. Он содержит 4 экзона и имеет около 13 тысяч пар оснований.
