Глутатионредуктаза
Основной источник: Н.Н.Чернов
карта белка Глутатионредуктаза
Глутатионредуктаза (glutathione reducease; NAD(P)H' окисленный глутатион оксидоредуктаза, (EC 1.6.4.2) - широко распространенный флавиновый фермент, поддерживающий высокую внутриклеточную концентрацию восстановленной формы глутатиона (GSH). Т.Гопкинс в 1931 г. открыл сопряженную с регенерацией окисленного NADЗ систему восстановления окисленного глутатиона (GSSG), а глутатионредуктаза была обнаружена в 1951 г. .Конном в растениях и в 1952 г. А.Ленинджером у животных. С тех пор глутатионредуктаза была выделена из различных источников и очищена до гомогенного состояния. Структура фермента из эритроцитов человека установлена с разрешением 0,15 нм. Глутатионредуктаза является одной из наиболее крупных белковых молекул, структура которых изучена на атомарном уровне.
Глутатионредуктаза катализирует обратимое NAD(P)H-зависимое восстановление GSSG с образованием 2 молекул GSHЖ
GSSG + NAD(P)H + H2GSH +NAD(P)
Отношение равновесных концентраций GSH/GSSG при pH 7,0 равно 1100. Оптимальное значение pH реакции с NADPH составляет 7,0-7,5, а с NADH смещается в более кислую область значений (~5). Скорость реакции с NADPH при pH 7,0 и ионной силе 0,15 М в 200 раз выше, чем с NADH, для которого кажущаяся величина К значительно выше, чем для NADPH.
Глутатионредуктаза обладает высокой специфичностью к глутатиону, однако с низкой скоростью может катализировать восстановление ряда других соединений, содержащих дисульфидную связь, и помимо основной, глутатионвосстанавливающей активности способна проявлять трансгидрогеназную, электронтрансферазную и диафоразную активности, хотя и в значительно меньшей степени. Глутатионредуктаза из Escherichia coli стала объектом генно-инженерных разработок, позволивших клонировать ген, ответственный за синтез фермента, картировать его, а также путем генетической трансформации в 200 раз повысить активность дикого штамма.
Глутатионредуктаза содержится в основном в растворимой части клеток. Фермент обнаружен также в составе хроматина ядер. Кроме того, есть основания полагать, что в печени крыс часть фермента находится в мембраносвязанном латентном состоянии. Эффективная очистка глутатионредуктазы достигается аффинной хроматографией на 2',5'-ADP-сефарозе с использованием специфической элюции NAD(P)H.
Усилиями нескольких групп немецких исследователей наиболее полно охарактеризована глутатионредуктаза из эритроцитов человека. Первичная структура фермента, установленная химическими методами в 1982 г., представлена на рис. 1.21. Каждая из двух идентичных субъединиц содержит 478 аминокислотных остатков и имеет молекулярную массу 52,4 кДа (с учетом 1 молекулы флавинадениндинуклеотида (FAD)). На рис. 1.21 приведена также аминокислотная последовательность глутатионредуктазы из E. coli, установленная в 1986 г. по нуклеотидной последовательности структурного гена. Обращает внимание высокая степень гомологии последовательностей аминокислот в молекулах ферментов, особенно в С-концевых участках. "Лишние" 16 N-концевых аминокислотных остатков в молекуле глутатионредуктазы из эритроцитов не имеют упорядоченной структуры и не участвуют в катализе.
Глутатионредуктаза из эритроцитов человека представляет собой димер с молекулярной массой 105 кДа, состоящий из двух идентичных субъединиц, каждая из которых содержит четыре структурных домена (рис. 1.22). Субъединицы связаны между собой дисульфидной связью, являющейся центром симметрии молекулы глутатионредуктазы. Каждая полипептидная цепь содержит одну молекулу FAD, 30% - альфа-спиральных участков и 30% -бета-складчатых структур.
На одной стороне каждой субъединицы в составе FAD-домена находится FAD-связывающий участок, а на противоположной в составе NADPH-домена - участок связывания NADPH. При этом участки связывания динуклеотидов обеспечивают максимальное сближение функционально активных флавиновой и никотинамидной частей молекул коферментов в глубоком кармане, тогда как адениловые остатки располагаются снару жи и удалены друг от друга на расстояние 2,9 нм (между атомами азота в положении 1). Г.Шульц предполагает, что динуклеотидсвязывающие домены молекулы глутатионредуктазы образуются в результате дупликации гена, т.е. эволюционно родственны.
N-Концевой участок каждой полипептидной цепи глутатионредуктазы, включающий 18 аминокислотных остатков, образует подвижную цепочку; предполагается, что остаток Cys-2 может приближаться к активному центру фермента (к остатку Cys-58). С-Концевой участок проходит через центральный и пограничный домены. GSSG присоединяется в полостях, образуемых между двумя субъединицами. Таким образом, в формировании двух активных центров глутатионредуктазы участвуют пять структурных доменов - все 4 домена одной субъединицы и пограничный домен другой.
Структура активного центра глутатионредуктазы, геометрия кото рого изучена с разрешением 0,2 нм методом рентгеноструктурного анализа, схематично представлена на рис. 1.23б. Остаток Tyr-197 (не показан) закрывает NADPH-связывающий карман в отсутствие кофермента. Присоединение NADPH (но не NADP ) вызывает смещение фенольного кольца Tyr-197, обеспечивающее доступ никотинамидной части NADPH к флавиновому кольцу FAD. Кольца коферментов расположены параллельно друг другу на расстоянии 0,34 нм (точность 0,05 нм). Амидная группа NADPH повернута на 20 относительно пиридинового кольца, так что кислород ее оказывается в центре птеридинового кольца флавина, а амидная группа образует водородные связи с карбоксильной группой Glu-201 и карбонилом Val-370 (не показан). Таким образом, углеродный атом в положении 4 пиримидинового кольца NADPH расположен близко к атому азота в положении 5 флавинового кольца (0,35 нм) и к со- левому мостику Lys-66:Glu-201. Между NH-группой флавинового кольца в положении 3 и карбонильной группой His-467' другой субъединицы образуется водородная связь. Имидазольная группа His-467', участвующая в переносе протона, фиксирована сильной водородной связью с Glu-472.
Важную роль в каталитическом акте играет способная к восстановлению дисульфидная группа, образованная между Cys-58 и Cys-63. Ее функциональная роль была установлена на основе химических и спектроскопических исследований дрожжевой глутатионредуктазы, а затем подтверждена данными рентгеноструктурного анализа для фермента из эритроцитов человека. Показано, что предполагаемое образование комплекса с переносом заряда между анионом S Cys-63 и окисленным флавиновым кольцом сопровождается слабым перемещением серы (порядка 0,01 нм) в сторону флавина (взаимодействие обозначено на рис. пунктиром). Таким образом, процесс переноса восстановительных эквивалентов протекает от никотинамида через флавин к дисульфидному мостику (Cys-58:Cys-63).
Присоединение окисленного глутатиона вызывает сдвиг фенольного кольца Tyr-114 на 0,1 нм, чем достигается его ориентация между остатками глицина GSH1 и GSH2. Между гидроксильной группой тирозина и обоими атомами серы GSSG устанавливаются ван-дер-ваальсовым взаимодействия. Интересно отметить, что в близкородственном флавиновом ферменте липоамид-дегидрогеназе со сходным строением активного центра вместо Tyr-114 находится гидрофобная аминокислота лейцин, за счет чего обеспечивается субстратная специфичность фермента. Разрыв дисульфидной связи между Cys-58 и Cys-63 сопровождается смещением S в сторону S GSH1 (расстояние между ними сокращается от 0,50 до 0,36 нм) и началом нуклеофильной атаки на S , в результате чего освобождается GSH2 и образуется смешанный дисульфид. При этом GSH2 получает протон от His-467' (рис. 1.23б). Новая нуклеофильная атака S на S приводит к расщеплению смешанного дисульфида и освобождению GSH1.
Данные кинетических, химических, спектроскопических и рентгено- структурных исследований механизма действия глутатионредуктазы суммированы на схеме, приведенной на рис. 1.24. Фермент, находяшийся в окисленном состоянии (I), присоединяет NADPH (II) и протон и переходит в восстановленную форму EH (III). При этом разрывается дисульфидная связь между Cys-58 и Cys-63, а имидазольное кольцо His-467' становится положительно заряженным. Судьба одного из водородов точно не установлена (он помещен между S и FAD). После ухода окисленного NADP (IV) происходит нуклеофильная атака S на GSSG (V), в результате которой освобождается GSH2 и образуется смешанный дисульфид (VI). Вторая нуклеофильная атака завершается освобождением GSH1 и регенерацией окисленной формы глутатионредуктазы. Интересно, что в обоих случаях и GSH1 и GSH2 получают атомы водорода от His-467' (первый перенос протона является лимитирующей стадией).
Кинетические характеристики глутатионредуктазы из различных источников отличаются кажущимися величинами K для NADP и NADPH, потребностью в добавлении FAD, степенью ингибирования продуктами реакции. В большинстве случаев постулирован кинетический "пинг- понг" механизм. Специфических внутриклеточных ингибиторов или активаторов глутатионредуктазы не обнаружено. Конкурентным ингибитором является NADP . Показано ингибирующее влияние на активность глутатионредуктазы противоопухолевых антибиотиков кармустина (N,N'-бис(2-хлорэтил)-N-нитрозомочевины) и антрациклина карминомицина, антидепрессанта азафена, а также 2,4-диоксибензиламина и нитрофуранов.
Глутатионредуктаза - один из примеров фермента, структура которого изучена значительно лучше, чем физиологическая роль. Активность глутатионредуктазы в сыворотке крови человека повышается при инфаркте миокарда, раке и гепатитах, а в эритроцитах - при наследственной недостаточности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, что позволяет использовать этот фермент в диагностических целях. Очищенные препараты глутатионредуктазы используют для количественного определения окисленного и восстановленного глутатиона.
Вызывает ли недостаточность глутатионредуктазы - ферментопатия пентозофосфатного пути - клинически значимый гемолиз , точно не установлено. У некоторых больных недостаточность глутатионредуктазы удается устранить с помощью рибофлавина , 5 мг/сут внутрь.
Литература
Boggaram V., Brobjer T., Larson K., Mannervik B. Purification of Glutathione reductase from porcine eryThrocytes by the use of affinity chromatograpHy on 2',5'-ADP-sepHarose 4B and crystallization of the enzyme // Anal. Biochem. - 1979. - Vol. 98. - P. 335- 340.
Schulz G.E., Schirmer R.H., Pai E.F. FAD-binding site of Glutathione reductase // J.Mol. Biol. - 1982. - Vol. 160. - P. 287-308.
Krauth-Siegel R.L., Blatterspiel R., Saleh M. et al. Glutathione reductase from human eryThrocytes. The sequences of the NADPH domain and of the interface domain // Eur. J. Biochem. - 1982. - Vol. 121. - P. 259-267.
Pai E.F., Schulz G.E. Catalytic mechanism of Glutathione reductase as derived from X-ray diffraction anaLyses of reaction intermediates // J. Biol. Chem. - 1983. - Vol. 258, No.3. - P. 1752- 1757.
Greer S., Perham R.N. Glutathione reductase from Escherichia coli; cloning and sequence anaLysis of the gene and relationship to other flavoprotein disulfide oxidoreductases // Biochemistry. - 1986. - Vol. 25. - P. 2736-2742.
Чернов Н.Н. Латентная форма глутатионредуктазы в печени крыс // Биохимия. - 1986. - Т. 51, вып. 5. - С. 762-769.
Karplus P.A., Schulz G.E. Refined structure of Glutathione reductase at 1,54 A resolution // J. Mol. Biol. -1987. - Vol. 195. - P. 701-729.
Vanoni M.A., Wong K.K., Ballou D.P. et al. Glutathione reductase: comparison of steady-state and rapid reaction primary kinetic isotope effects exhibited by the yeast, spinach, and Escherichia coli enzymes // Biochemistry. - 1990. - Vol. 29. - P. 5790-5796.
Cenas N.K., Bironaite D.A., KuLys J.J. et al. Interaction of nitrofurans with Glutathione reductase // Biochim. BiopHys. Acta. - 1991. - Vol. 1073. - P. 195-199.
