Плавление ДНК (DNA melting)
Плавление ДНК (DNA melting): процесс разрушения вторичной упорядоченной структуры двухцепочечной ДНК , приводящий к образованию разделенных одноцепочечных комплементарных нитей .
При плавлении происходит переход регулярной двойной спирали линейной молекулы ДНК в клубкообразное состояние. Переход спираль-клубок может быть вызван различными факторами, но, как правило, исследуется температурный переход. Наблюдение за переходом может осуществляться различными методами, так как он сопровождается изменением многих физических свойств ДНК ( Кантор Ч. и Шиммел П., 1984 ), наиболее часто для количественных измерений степени перехода используется изменение поглощения света раствором ДНК в области длин волнa l = 250-270 нм. При переходе ДНК из спирального состояния в клубкообразное поглощение раствора A в этой области длин волн увеличивается на 30-40%, и для определения средней степени перехода q, т.е. доли звеньев, находящихся в клубкообразном состоянии, можно использовать соотношение:
q, = (A - Aсп)/(Aкл - Aсп) (1),
где через Aсп и Aкл обозначено поглощение ДНК в полностью спиральном и полностью клубкообразном состоянии, соответственно. Этот метод позволяет регистрировать q,с точностью, превышающей 0,1%. Плавление высокомолекулярной ДНК занимает интервал температур от 3 до 20 градусов в зависимости от распределения AT- и GC-пар вдоль молекулы. В качестве простейшей характеристики плавления такой ДНК обычно используют температуру плавления Tm, которая определяется как температура, при которой половина звеньев молекулы находится в клубкообразном состоянии. При заданном составе растворителя температура плавления линейно зависит от доли GC-пар в ДНК, xGC ( Кантор Ч. и Шиммел П., 1984 ):
Тm = ТАТ + (ТGC - TAT)*xGC (2),
где через TAT и TGC обозначены температуры плавления молекул ДНК, состоящих только из AT- и только из GC-пар, соответственно.
В середине 70-х годов было обнаружено, что кривая плавления ДНК, т.е. зависимость q от T, обладает тонкой структурой, если длина ДНК не превышает нескольких десятков тысяч пар оснований ( Dickerson R.E., 1983 ). Особенно ярко эта тонкая структура проявляется на дифференциальной кривой плавления, т. е. зависимости dq/dT от T. Пример такой дифференциальной кривой плавления приведен на Рис. Дифференциальные кривые плавления для фрагмента ДНК фага fd. Конкретный профиль плавления, который отражают такие кривые, определяется последовательностью оснований в исследуемой ДНК. Эти пики на дифференциальных кривых плавления связаны с выплавлением в интервале в несколько десятых градуса отдельных участков молекулы с характерным размером в несколько сотен пар оснований.
Существует хорошо разработанное статистико-механическое описание перехода спираль-клубок в ДНК. Открытие тонкой структуры кривых плавления и расшифровка длинных последовательностей ДНК позволили провести очень критичную проверку возможностей теоретического описания перехода спираль-клубок. Прямое сравнение теоретических и экспериментальных профилей плавления ДНК длиной до нескольких тысяч пар оснований показало, что статистико- механическая модель перехода хорошо описывает реальное плавление ДНК. Достаточно типичный пример такого сравнения показан на Рис. Дифференциальные кривые плавления .
Плавление отрицательно сверхспирализованной ДНК начинается при значительно более низких температурах, чем плавление соответствующих линейных молекул, а заканчивается при значительно более высоких температурах. Ясно, что до тех пор, пока знак напряжения сверхспирализации способствует раскручиванию двойной спирали, т.е. пока степень денатурации q меньше величины s, это напряжение должно способствовать денатурации. При q больше или равно s , расплавленные участки начинают приобретать остаточную закрученность, так как кручения в спиральных областях уже недостаточно для реализации имеющегося в молекуле порядка зацепления нитей, и тем самым топологические ограничения затрудняют дальнейшее плавление ДНК . Именно топологические ограничения, а не распределение AT- и GC-пар оснований вдоль цепи и их относительная стабильность, определяют характер плавления кольцевой замкнутой ДНК. Это было убедительно показано в работе ( Gagua A.V. ea, 1981 ), где изучалось плавление кольцевой замкнутой формы ДНК в тетраметиламмониевых солях, при определенной концентрации которых температуры плавления AT- и GC-пар совпадают. В этих условиях интервал плавления линейной ДНК сужается до нескольких десятых градуса ( Melchior W.B. and von Hippel P.H., 1973 и Воскобойник А.Д. и др., 1975 ). Однако характер плавления КЗ формы практически не меняется, и переход остается очень широким, начинаясь при 55 градусах С и заканчиваясь при 110 градусах С.
