Распространение суперинтегронов среди псевдомонад
Открытию суперинтегрона в хромосоме штамма АТСС55044 Pseudomonas alcaligenes предшествовало обнаружение в его геноме большого числа повторяющихся последовательностей, проявляющих большое сходство между собой (PAR-элементы от Pseudomonas alcaligenes repeats, около 90% гомологии) [ Vaisvila, 2001 ]. Клонирование больших перекрывающихся фрагментов ДНК, содержащих PAR- элементы, и последующее их секвенирование выявило наличие структуры, сходной с открытым ранее суперинтегроном холерного вибриона . Детальное изучение свойств и структурной организации суперинтегрона P. alcaligenes показало, что он содержит PAR-элементы, перемежающиеся с открытыми рамками считывания. В целом в интегроне насчитывается 32 полных и 1 укороченный PAR-элемент и 31 ORF в 33 генных кассетах . Две кассеты содержат некодирующие последовательности, идентичные между собой на 85%. Функции этих кассет неизвестны, хотя компьютерный анализ показал присутствие в них промоторных последовательностей. Такие кассеты, внедряясь между кодирующими кассетами, возможно, действуют как мобильные промоторы, обеспечивающие экспрессию генов других кассет. Некодирующие кассеты обнаружены также в составе суперинтегрона холерного вибриона , но они отличаются по нуклеотидному составу от найденных в суперинтегроне псевдомонады. Компьютерный анализ кассетных ORF не выявил сходства с генами известных белков, но позволил предположить, что продукты большинства из них связаны с клеточными оболочками.
Нуклеотидная последовательность, составляющая суперинтегрон, имеет протяженность, равную 18042 пн. ORF генных кассет по составу G+C (от 39 до 58%) и по использованию кодонов значительно отличаются между собой и от хромосомной ДНК (G+C = 64%), что свидетельствует об их чужеродном происхождении. Генные кассеты отличаются выбором кодонов и от гена, кодирующего интегразу, который по этому признаку стоит ближе к генам хозяина. Это послужило основанием для предположения, что ген int либо эволюционировал вместе с геномом псевдомонад, либо он был приобретен, но значительно раньше, чем кассеты. Подобно другим членам семейства тирозиновых рекомбиназ белок IntI содержит С-терминальную область, включающую активный тирозин [ Nunes-Duby, 1998 ], и имеет наиболее выраженное родство с интегразами Nitrosomonas europaea , Xanthomonas campestrii и интегразами IntI6 , IntI7 и IntI8 , гены которых были восстановлены с помощью ПЦР из почвенных образцов [ Nemergut, 2004 ].
PAR-элементы по структурной организации сходны с attC-сайтами генных кассет традиционных интегронов, отличаясь, однако, наличием специфической дополнительной последовательности ("PAR signature"). Кроме того, в отличие от них, как и VCR , PAR-элементы образуют семейство очень консервативных последовательностей, гомологичных между собой на 90% и более. Однако их подразделяют на три подсемейства, внутри которых они практически не различаются, но между собой варьируют по размеру (от 67 до 90 пн) и по последовательностям нуклеотидов. Существование трех подсемейств, по-видимому, свидетельствует о более сложной эволюции этого типа интегронов по сравнению с суперинтегроном V. cholerae .
PAR-подобные элементы обнаружены также в интегронах с кассетами лекарственной устойчивости: в интегроне In31 Pseudomonas aeruginosa [ Laraki, 1999 ] attC-сайт генной кассеты имеет последовательность, на 92% идентичную последовательностям элементов PAR-I подсемейства, а интегрон IntAb74 Acinetobacter baumannii [ Ploy, 2000 ] содержит генную кассету с attC-сайтом, гомологичным на 98% с PAR-6 (подсемейство PAR-I). Наряду с этим в расшифрованной не до конца последовательности нуклеотидов генома Schewanella oneidensis были идентифицированы две одиночные, не связанные с другими, кассеты, содержащие сайты attC, гомологичные PAR-10 и PAR-30 (подсемейства PAR-I и PAR-III соответственно). Функции связанных с ними генов не установлены [ Vaisvila, 2001 ].
Ряды ORF, перемежающиеся с PAR-подобными элементами, обнаружены также в геномах представителей трех других видов псевдомонад - Pseudomonas mendocina , Pseudomonas stutzeri и Pseudomonas sp. , широко распространенных в почве и водоемах [ Vaisvila, 2001 ]. Как и у представителей семейства Vibrionaceae, интегроны каждого вида содержали неперекрывающиеся наборы генных кассет , имели различную степень сходства в нуклеотидных последовательностях генов интеграз и вариабельных участках кассетных рекомбинационных сайтов. Интересно, что выделенные из почвы два штамма, Q и BAM, одного и того же вида P. stutzeri содержали в хромосомах интегроны, отнесенные к одному новому классу, но, тем не менее, отличающиеся составом генных кассет [ Holmes, 2003 ].
Суперинтегрон P. alcaligenes по своей структурной организации похож на суперинтегрон холерного вибриона, но имеет и отличающиеся черты. Так, его размер примерно в 5 раз меньше, чем размер кассетного ряда суперинтегрона V. cholerae, и, возможно, он подвергался перестройкам. 5'-конец суперинтегрона содержит интегразный ген в той же ориентации, как и у других охарактеризованных интегронов. З'-конец суперинтегрона сцеплен с хромосомным геном, имеющим обычный для P. alcaligenes G+C-состав. Присутствие в нем укороченного PAR-элемента скорее всего свидетельствует о том, что часть суперинтегрона была делетирована или в ней произошли другого рода хромосомные перестройки. Другая отличительная черта - дивергенция между PAR-элементами. Три подсемейства этих элементов имеют разные размеры и различающиеся последовательности в вариабельных участках, тогда как у холерного вибриона VCR-элементы очень однообразны и их вариабельные участки практически одинаковы.
Происхождение подсемейств PAR-элементов неясно. Наиболее простым объяснением их происхождения может быть вероятность приобретения кассет разных подсемейств либо в разное время из одного источника, либо из различных, но родственных источников.
Для кассетных ORF у псевдомонад характерны три черты - отсутствие сходства с генами известных белков, отличия в использовании кодонов, предполагающие участие горизонтального переноса, и наличие большой фракции кассет, продукты которых, по всей видимости, связаны с клеточной оболочкой. Все это позволило предположить, что кассетные ряды в составе хромосом псевдомонад играют важную роль во взаимодействии с окружающей средой.
