Белок Rb: Общая характеристика
Rb ген кодирует белок с электрофоретической подвижностью соответствующей массе от 105 до 115 кДа в зависимости от степени фосфорилирования ( Wang и сотр., 1993 -- обзор).
Ретинобластомный белок рRB - ядерный фосфопротеин, является негативным регулятором клеточной пролиферации. Активация белка зависит от степени его фосфорилирования и носит в клетках циклический характер ( Buchkovich et al. 1989 ; Chen and De Caprio, 1989 ).
Так как экспрессия гена Rb является конститутивной, предполагают, что регуляция активности Rb производится за счет фосфорилирования белка . Степень фосфорилирования зависит от фазы клеточного цикла, причем в фазах G0 и G1 Rb является гипофосфорилированным, тогда как в фазах S , G2 и M он гиперфосфорилирован ( Ludlow и сотр., 1990 ). Микроинъекция гипофосфорилированного Rb в клетки в ранней фазе останавливает развитие клеточного цикла, тогда как микроинъекция в поздней G1 или позднее не имеет эффекта ( Goodrich и сотр., 1991 ). Эти данные указывают на то, что Rb регулирует вступление клетки в клеточный цикл . Следует отметить, что для подавления роста достаточна была микроинъекция С-концевого фрагмента Rb массой около 60 кДа.
В нормальных клетках pRb экспрессируется на протяжении всего клеточного цикла, но белок в различной степени подвергается посттрансляционной модификации, которая регулируется путем фосфорилирования и дефосфорилирования с помощью циклин-зависимых РБ-киназ и фосфатаз. Слабое фосфорилирование происходит в G0- и в G1-фазах клеточного цикла, тогда как полное фосфорилирование белка осуществляется киназами на границе перехода G1 в S стадию клеточного цикла. Белок рRb активен только в слабофосфорилированном состоянии ( Buchovich et al. 1989 ; De Caprio et al. 1989 ). В нефосфорилированном или гиперфосфорилированном состоянии белок рRB не активен, т.е. не может связяться с фактором транскрипции E2F . Анализ фосфорилирования pRB in vitro и in vivo показал, что фосфорилирование pRB в ходе клеточного цикла способны осуществлять активированные протеинкиназы р33cdk2, p34cdk4 и p34cdk2. Продукт гена Rb1 регулирует экспрессию различных клеточных генов, контролирующих рост клеток.
В активном гипофосфорилированном состоянии белок RB способен связывать фактор инициации транскрипции E2F ( Dyson, 1998 ), который является регулятором транскрипции большого числа клеточных генов (например: ДНК полимераза II, DHFR-дигидрофолатредуктаза, р19), ответственных за пролиферацию. В комплексе с pRB этот фактор не способен связываться с промоторной областью генов в результате чего происходит ингибирование транскрипции и задержка клетки в G1 фазе клеточного цикла. Фосфорилирование pRB на этом этапе осуществляется циклин-зависимыми киназами cdk4 и cdk6, связанными с D- циклином.
Белок р16/Ink4A ингибирует связывание циклинов D-типа с киназами cdk4/6, контролируя, таким образом, переход клетки из фазы G1 в фазу S.
Через различные промоторные элементы, такие как семейство Sp транскрипционных факторов, pRB регулирует общую экспрессию ядерных белков. Но, в тоже время, белок pRB увеличивает активность некоторых факторов транскрипции (например, C/EBP ), участвующих в конечных этапах клеточной дифференцировки ( Lee and Lee, 1997 ).
Таким образом, pRB выполняет супрессорную роль в опухолеобразовании - препятствует пролиферации, способствует окончательной дифференцировке клеток.
В вирустрансформированных клетках C-концевая область pRB способна формировать специфические комплексы с трансформирующими белками некоторых ДНК-содержащих онкогенных вирусов, включая большой Т-клеточный антиген вируса SV40 , белки аденовируса E1A и человеческого вируса папилломы E7 ( De Caprio et al. 1989 ; Whyte et al. 1988 ; Dyson et al. 1989 ; Munger et al. 1989 ). Эти белки являются факторами, активирующими промоторы генов-регуляторов клеточной пролиферации: c-myc , N-myc , ELF1 , PU1 , c-myb и ряда других генов. Экспрессия протоонкогенов в нормальной клетке необходима для инициирования клеточной пролиферации и начало их работы приходится как раз на G0-G1 стадии цикла. Продукт гена Rb1 является негативным регулятором экспрессии этих генов.
Большое значение придается эпигенетической регуляции генной экспрессии. Некоторые продукты генов-супрессоров опухолевого роста влияют на хроматиновую структуру так, что это может приводить к активации или репрессии транскрипции. Структура хроматина может изменяться в результате посттрансляционной модификации ее компонентов. Например, ацетилирование и деацетилирование лизиноых остатков N-концевых участков гистонов. В 1999 опубликован ряд работ ( Bremh and Kouzaridies ) в которых показано участие белка RB в деацетилировании белков. Белок RB может связываться с двумя белками HDAC (histone deacetilase) семейства - HDAC1 и HDAC2. Luo (1999) используя метод иммунопреципитации (CHIP) показали, что статус ацетилирования гистонов изменяется после связывания с pRB. В эксперименте in vitro показано, что во время G0 и G1 фазы клеточного цикла формируется тройной комплекс состоящий из фактора транскрипции E2F, белка RB, активированной деацетилазы ( HDAC1 ), а также других транскрипционных факторов ( рис. 2 ). HDAC1 воздействует на нуклеосомы, окружающие промоторные области генов, активных в S фазу, и препятствует их ацетилированию. Это влияние индуцирует изменение конформационной структуры компонентов хроматина, и формируется, так называемая, "закрытая" форма хроматина, что вызывает инактивацию транскрипции. При переходе клетки из фазы G1 в фазу S, происходит гиперфосфорилирование белка RB, вследствие чего комплекс E2F-pRB-HDAC1 распадается. Это приводит к ацетилированию гистонов и формированию "открытой" - активной - структуры хроматина. Транскрипционные факторы (ТФ) получают доступ к промоторной области генов, и происходит активация транскрипции.
Таким образом, степень фосфорилирования pRb определяет механизм контроля инициации транскрипции генов, ответственных за клеточную пролиферацию. В случае отсутствия данного белка или невозможности осуществления его функции происходит сбой в регуляции деления клетки, что приводит к опухолевой трансформации.
