RNAi-путь
Хотя термин "RNAi" первоначально использовался для описания сайленсинга, который опосредуется экзогенной dsRNA у С. elegans ( Fire et al., 1998 ), сейчас он в широком плане обозначает сайленсинг генов , включаемый dsRNA того или иного рода. Этапы RNAi включают образование dsRNA (которая может быть эндогенной или экзогенной, как, например, вирусная РНК), ее процессинг в siRNA и "нацеливание" этих молекул либо на hRNAs ( PTGS ), либо на участки хроматина ( TGS ), чтобы вызвать сайленсинг. Поэтому, прежде чем представить компоненты механизма RNAi, специфичные для TGS, мы обсудим источник dsRNA, запускающих механизм RNAi.
dsRNA могут образовываться в результате двунаправленной транскрипции повторяющихся элементов ДНК или транскрипции молекул РНК, спсобных к спариванию оснований внутри себя с образованием сегментов dsRNA ( рис. 8.1 , а и б, соответственно). Например, транскрипция с участков инвертированных повторов дает молекулы РНК, складывающиеся сами на себя с образованием шпилечных структур. Затем dsRNA расщепляются ферментом Dicer - рибонуклеазой класса RNase III, которая генерирует siRNAs . siRNAs - это комплементарные дуплексы величиной 21-27 нуклеотидов, обладающие характерным "свисающим концом" [overhang] длиной 2 нуклеотида на каждом 3'-конце дуплекса ( Hamilton and Baulcombe, 1999 ; Zamore et al., 2000 ; Bernstein et al., 2001 ; Elbashir et al., 2001 ; Hannon, 2002 ; Zamore, 2002 ; Bartel, 2004 ; Baulcombe, 2004 ). Эти дуплексы раскручиваются в однонитевые siRNAs, которые действуют как "проводники", взаимодействуя на основе спаривания оснований с комплементарными последовательностями-мишенями. Они являются, следовательно, факторами специфичности и играют центральную роль во всех механизмах сайленсинга, опосредованных RNAi.
На данный момент идентифицированы два родственных комплекса, включающие siRNA; RISC и RITS . В комплексе RISC (RNA-Induced Silencing Complex) siRNAs распознают иRNAs-"мишени" и инициируют их деградацию путем эндонуклеолитического расщепления в пределах участка иRNA, спаренного с siRNA ( Hannon, 2002 ; Bartel, 2004 ). Этот первоначальный акт расщепления выполняет РНКаза-Н-домен белка семейства Argonaute / PIWI (субъединица RISC). В ядерном комплексе RITS (RNA-Induced Transcriptional Silencing), сходном с RISC, siRNAs "нацеливают" этот комплекс на хромосомные участки для модификации хроматина ( Verdel et al., 2004 ; Buhler et al., 2006 ). Это и есть RITS-опосредованный РНК-путь - центральная тема этой главы.
Для механизма РНК-сайленсинга дополнительного типа с участием микроРНК (miRNA) требуются ключевые белки Argonaute и Dicer . HYR , транскрибированная с эндогенных некодирующих генов и исходно образующая шпилечные РНК-структуры благодаря растянутым dsRNA-участкам, в несколько этапов процессируется в miRNA ( Bartel, 2004 ; Filipowiicz et al., 2005 ). Подобно siRNAs, miRNAs имеют размеры 21-24 нуклеотида и образуют часть RISC через посредство белков Argonaute для "нацеливания" на специфические иРНК. Результатом этого "нацеливания" может быть расщепление посредством PIWI/RNaseH-домена и репрессия трансляции, включая взаимодействия с кэпом 7meG на 5'-конце иРНК. Это может сочетаться с секвестрированием иРНК в цитоплазматических РНК-процессирующих органеллах, известных как Р-тельца (Processing bodies).
Таким образом, к образованию siRNA или miRNA приводят по крайней мере два разных пути процессинга dsRNA; тем не менее, эти РНК используют сходные средства для инактивации сходных иРНК. Путь miRNA отличается, поскольку все miRNAs производятся эндогенными некодирующими генами, которые в основном регулируются процессами развития и, в свою очередь, обычно "нацеливают" и регулируют в развитии сайленсинг гомологичных генов.
Хотя dsRNAs могут образовываться путем отжига прямонаправленной и инверсной РНК, получающихся в результате двунаправленной транскрипции, или присутствуют в виде шпилечных структур, в некоторых клетках для RNAi требуется дополнительный энзим для образования dsRNA. Этот фермент - РНК-направляемая РНК-полимераза ( RdRP ), обнаруженная у растений и у С. elegans ( Dalmay et al., 2000 ; Sijen et al., 2001 ). Он использует siRNAs в качестве праймеров для генерации большого количества dsRNA, которые затем могут процессироваться Dicer в дополнительные siRNA. Таким образом, считается, что первичная функция RdRP - амплификация RNAi- ответа, но, как мы обсудим позже, RdRP может играть и более специфическую роль в инициации синтеза dsRNA (см. далее " Синтез dsRNA и образование siRNA "). Действительно, она, по-видимому, участвует в процессе, приспособленном для формирования лучшей защитной реакции хозяина в ответ на введение экзогенной dsRNA. Эта идея подкрепляется тем фактом, что RdRPs не являются участниками путей сайленсинга с помощью miRNA ( Sijen et al., 2001 ). Интересно, что в геномах насекомых (в том числе Drosophila) и позвоночных (включая млекопитающих) отсутствуют распознаваемые RdRP-подобные последовательности, но остается возможность, что у этих организмов синтез dsRNA выполняют другие полимеразы.
Какова же тогда функция этих разнообразных механизмов РНК-сайленсинга? Они весьма консервативны у широкого круга организмов, от дробянковых дрожжей и растений до человека, и они играют центральные роли в регуляции экспрессии генов и стабильности генома (через формирование стабильного гетерохроматина в центромерах и теломерах ). Кроме того, эти механизмы сайленсинга принимают участие в защите против транспозонов и РНК-вирусов путем разрушения их РНК-транскриптов ( Plasterk, 2002 ; Li and Ding, 2005 ). Наконец, транскрипция с некоторых транспозонов приводит к образованию аберрантных РНК, включающих RNAi с помощью механизма, конвертирующего, как полагают, аберрантные транскрипты в dsRNA с помощью RdRPs ( рис. 8.1 ) ( Baulcombe, 2004 ).
