Синтез dsRNA и образование siRNA

Двунаправленная транскрипция центромерных ДНК-повторов в принципе могла бы обеспечить первоначальный источник dsRNA у дробянковых дрожжей ( Volpe et al., 2002 ). dsRNA, получающиеся в результате отжига "прямых" и "обратных" транскриптов, могли бы затем стать субстратом для рибонуклеазы Dicer . Однако РНК-направляемая РНК-полимераза ( Rdp1 ) и связанные с нею кофакторы, а также НКМТ Сlr4 , также необходимы для производства siRNA рибонуклеазой Dicer (Hong et al., 2005; Li et al., 2005; Buhler et al., 2006). Эти наблюдения показывают, что образование гетерохроматиновых siRNAs рибонуклеазой Dicer сопряжено с событиями, зависящими от хроматина и Rdp1 (рис. 8.4).

Фермент Rdp1 находится в мультипротеиновом комплексе, который содержит также Hrr1 , РНК-геликазу, и Cidl2 , члена бета-семейства ДНК-полимераз, включающего поли(A)полимеразные ферменты ( Motamedi et al., 2004 ). Этот комплекс был назван комплексом РНК-направляемой РНК-полимеразы ( RDRC - RNA-directed RNA polymerase complex), и для формирования гетерохроматина в районах центромерной ДНК требуются все его субъединицы ( Motamedi et al., 2004 ). Как ожидалось, на основании присутствия Rdp1 RDRC обладает активностью РНК-направляемой РНК-полимеразы in vitro, и мутации, устраняющие эту активность, устраняют и зависимый от RNAi сайленсинг in vivo ( Motamedi et al., 2004 ; Sugiyama et al., 2005 ). Активность RDRC, обусловливающая синтез РНК in vitro, не требует siRNA-праймера ( Motamedi et al., 2004 ). RITS может, следовательно, обеспечить in vivo специфичность путем рекрутирования RDRC к выбранным РНК-матрицам посредством siRNA. В согласии с этой гипотезой, субъединицы RDRC необходимы для генерации siRNA, а комплексы RITS, изолированные из клеток, не имеющих ни одной субъединицы RDRC, лишены siRNAs ( Motamedi et al., 2004 ; Li et al., 2005 ; Sugiyama et al., 2005 ; Buhler et al., 2006 ).

Присутствие Cidl2 в RDRC интригует и ставит вопрос о возможности участия еще одной полимеразной активности в связанном с хромосомой РНК-сайленсинге. Поскольку некоторые члены этого семейства обладают активностью поли(A)полимеразы, одна из возможностей заключается в том, что аденилирование dsRNA, произведенной Rdp1, может иметь важное значение для их дальнейшего процессинга. Интересно, что Cidl2-подобные белки консервативны у всех эукариот ( табл. 8.1 ); результатом мутаций в Rde-З , характерном для С. elegans члене этого семейства, является дефектная RNAi ( Chen et al., 2005 ), что подтверждает консервативную роль этих ферментов в RNAi-пути.

Имеются данные по синтезу и процессингу dsRNA, связанному с образованием гетерохроматиновых siR-NAs, происходящим на хромосоме, в сайтах транскрипции некодирующих центромерные РНК ( рис. 8.4 ). Среди них, во-первых, данные о том, что Rdp1 может быть присоединена поперечными сшивками к центромерным ДНК-повторам ( Volpe et al., 2002 ; Sugiyama et al., 2005 ) и к "прямым" и "обратным" РНК-транскриптам, происходящим из этих районов ( Motamedi et al., 2004 ). Как и в случае поперечных сшивок с ДНК, присоединение поперечными сшивками к центромерным РНК требует участия Dicer и Сlr4 и, следовательно, является зависимым от siRNA и хроматина. Во-вторых, для производства siRNA требуются компоненты хроматина, в том числе Clr4 , Swi6 и PBAC Sir2 ( Hong et al., 2005 ; Li et al., 2005 ; Buhler et al., 2006 ). Наконец, ассоциация RDRC с RITS зависит от siRNAs, а также от Clr4, что заставляет предполагать, что она происходит на хроматине ( Motamedi et al., 2004 ). Таким образом, образование dsRNA и siRNAs гетерохроматина может включать рекрутирование RDRC к связанным с хроматином вновь синтезирующимся пре-иРНК-транскриптам, как это показано на рис. 8.5 ( Martienssen et al., 2005 ; Verdel and Moazed, 2005 ). Тот факт, что транскрипция и образование siRNA происходят, вероятно, одновременно, усиливает различие между механизмами РНК-сайленсинга, опосредующими модификации хроматина, и PTGS . Однако маловероятно, чтобы это различие было абсолютным. Например, у С. elegans мутации в нескольких компонентах хроматина, подобные мутациям у S. pombe , приводят к дефектам в RNAi и индуцируемом транспозонами РНК-сайленсинге ( табл. 8.1 ) ( Sijen and Plasterk, 2003 ; Grishok et al., 2005 ; Kim et al., 2005 ), и возникает возможность, что в некоторых случаях синтез и процессинг dsRNA могут происходить на хромосоме независимо от того, происходит ли сайленсинг на уровне TGS или же PTGS .

Ссылки: