Schizosaccharomyces pombe: центромеры
Центромеры дробянковых дрожжей состоят из разных гетерохроматиновых и центральных кинетохорных доменов.
У дробянковых дрожжей разница в качестве сайленсинга по длине центромер отражает тот факт, что репрессия транскрипции является результатом разных хроматиновых структур, включая ассоциации различных негистоновых белков, во внешних повторах и в центральном домене ( Partridge et al., 2000 ). Имеются две разные хроматиновые структуры, которые были охарактеризованы в центромерных районах дробянковых дрожжей: гетерохроматин над участками внешних повторов и хроматин "CENP-A" , покрывающий центральный домен, где собирается кинетохор . В этих двух доменах с сайленсингом репортерных генов связаны (и для него требуются) разные белки.
Гетерохроматин. В хроматине аминотерминальные "хвосты" гистона НЗ и гистона Н4 подвержены ряду посттрансляционных модификаций, которые обычно коррелируют с активными или репрессивными состояниями (см. " Эпигенетика: общий обзор и основные понятия "). Центромерный гетерохроматин во внешних повторах ассоциируется с ди- и триметильными состояниями гистона НЗ по лизину 9 ( НЗК9me2 и НЗК9meЗ ) ( Nakayama et al., 2001 ; Yamada et al., 2005 ). Для формирования центромерного гетерохроматина требуется действие нескольких белков, модифицирующих хроматин и, тем самым, стимулирующих связывание других факторов. Для формирования гетерохроматина сначала требуются деацетилазы гистонов ( HDACs ; такие как СlrЗ , Сlr6 и Sir2 ), чтобы деацетилировать гистон НЗ. Это впоследствии позволяет метилтрансферазе лизина гистонов ( НКМТ ) Сlr4 метилировать гистон НЗ по лизину 9 над центромерными внешними повторами. Эта модификация создает специфический сайт связывания, который распознается хромодоменным мотивом, присутствующим в Swi6 и Chp2 (гомологах гетерохроматинового белка 1 [ НР1 ]) и в еще одном хромодоменном белке Chp1 ( рис. 6.2 b). Все эти белки вносят вклад в формирование "молчащего" хроматина над внешними повторами ( Allshire et al., 1995 ; Cowieson et al., 2000 ; Partridge et al., 2000 ; Bannister et al., 2001 ; Nakayama et al., 2001 ; Shankaranarayana et al., 2003 ; Sadaie et al., 2004 ).
Хроматин, ассоциированный со вставками репортерного гена во внешние повторы (например, гена ura4+ ), заметно обогащен белками НЗК9me2 и Swi6. Это показывает, что модификация хроматина и Swi6 могут распространяться из соседней центромерной повторяющейся ДНК в вклинивающиеся [interposing] последовательности ( Cowieson et al., 2000 ; Nakayama et al., 2001 ). Локализация Swi6 и сайленсинг зависят от метилирования НЗК9, что иллюстрируется нарушением локализации Swi6 в клетках, у которых нет специфичной для НЗК9 НКМТ, Сlr4, или у мутантов по НЗ, где лизин 9 замещен аргинином ( Ekwall et al., 1996 ; Mellone et al., 2003 ). Белок Swi6 димеризуется через свой "chromoshadow"-домен ( Cowieson et al., 2000 ) и это, вероятно, облегчает его распространение вдоль хроматиновых фибрилл, которому способствует последовательное действие HDACs и специфичной для НЗК9 НКМТ Сlr4.
Кроме Swi6, с хроматином внешних повторов в центромерах ассоциируются также хромодоменные белки Chp1 и Chp2 путем связывания гистона НЗ, метилированного по лизину 9. Было показано, что Chp1 является компонентом эффекторного комплекса RNAi, RITS (см. " RNAi и сборка гетерохроматина "), и необходим для полного метилирования гистона НЗК9 над внешними повторами и вставленными репортерными генами ( Partridge et al., 2002 ; Motamedi et al., 2004 ; Sadaie etal., 2004 ).
Хроматин центрального кинетохорного домена. Прежде чем обсуждать детали формирования гетерохроматина на внешних повторах в центромерах, важно принять во внимание, что хроматин центрального домена, где собирается кинетохор , очень отличается от гетерохроматина, фланкирующего внешние повторы, потому что именно там собирается кинетохор. В противоположность сайленсингу во внешних повторах сайленсинг репортерных генов в центральном домене cen1 (имеющем длину приблизительно 10 т.о.), по существу, не зависит от Сlr4 и поэтому не связан с метилированием гистона НЗ по лизину 9. Действительно, было показано, что центральный домен обладает отличающимся составом хроматина. Первоначально это было продемонстрировано в ходе анализа с использованием микрококковой нуклеазы, MNase , когда обнаружили "мазок" [smear] в противоположность регулярной "лесенке" с интервалом 150 п.н., характерной для хроматина фланкирующих внешних повторов ( Polizzi and Clarke, 1991 ; Takahashi et al., 1992 ). Этот особый паттерн отличает хроматин центрального домена от гетерохроматина и эухроматина и имеет отношение к его сборке в особом CENP-A-хроматине и сборке кинетохора над этим районом. У всех изученных эукариот с активными центромерами специфически связывается белок, подобный гистону НЗ и известный как CENP-A (или cenHЗ) , ( Cleveland et al., 2003 ), а CENP-A-хроматин играет решающую роль в определении места сборки кинетохора ( рис. 6.2 b).
В хроматине центрального домена центромер у дробянковых дрожжей большая часть гистона НЗ замещена ортологом CENP-A, известным как Cnp1 ( рис. 6.4 b) ( Takahashi et al., 2000 ). Откладка CENP-A(Cnp1) может происходить зависимым от репликации образом в фазе S или независимым от репликации способом в G2 (дополнительные детали см. в главе " Варианты гистонов и эпигенетика "). Кинетохорные белки сами управляют локализацией и сборкой CENP-A(Cnp1) специфически в пределах центрального домена центромеры ( Goshima et al., 1999 ; Takahashi et al., 2000 ; Pidoux et al., 2003 ). Ams2 ( фактор GATA ), например, управляет связанной с репликацией откладкой CENP-A(Cnp1) в фазе S. В его отсутствие независимая от репликации откладка с помощью Mis6 в G2 может обеспечивать компенсацию, доводя уровни CENP-A(Cnp1) до максимума в интерфазе ( Chen et al., 2003 ; Takahashi et al., 2005 ). Если структура хроматина CENP-A(Cnp1) разрушается (как в случае мутантов cnp1, mal2, mis6, sim4 и других), специфический "смазанный" паттерн, получаемый при обработке микрококковой нуклеазой, превращается в паттерн, более типичный для основной массы хроматина (т.е. в нуклеосомную "лесенку"). Мутанты, затрагивающие хроматин центрального домена, не оказывают никакого заметного влияния на сайленсинг во внешних повторах ( Cowieson et al., 2000 ; Jin et al., 2002 ; Pidoux et al., 2003 ; Hayashi et al., 2004 ). Более того, тот факт, что CENP-A(Cnp1), Маl2, Mis6, Sim4 и другие кинетохорные белки связываются только с центральным доменом, показывает, что центральный кинетохорный домен является структурно сложным и функционально отличается от "молчащего" хроматина внешних повторов ( рис. 6.2 b).
Были протестированы не все белки кинетохорного домена, но создается впечатление, что сайленсинг в центральном домене является результатом сборки интактного кинетохора, который, как и у S. cerevisiae , включает по меньшей мере 50 белков ( Measday and Hieter, 2004 ). Этот крупный комплекс белков предположительно ограничивает доступ РНК-полимеразы II к репортерным генам, помещенным в этот район, и тем самым тормозит их транскрипцию. У таких мутантов, как cnp1, mal2, mis6 и sim4, при пермиссивной температуре целостность кинетохора, несомненно, частично нарушена, и это делает возможной увеличенную транскрипцию репортерных генов. Побочный результат этого состоит в том, что в норме "молчащий" репортерный ген был использован для тестирования дефектов в хроматине центрального кора, что привело к идентификации новых кинетохорных белков ( Pidoux et al., 2003 ).
Центромерные районы не полностью лишены генов, и любопытно, что несколько генов тРНК находятся между внешними повторами и центральным кинетохорным районом ( рис. 6.2 a) ( Kuhn et al., 1991 ; Takahashi et al., 1991 ). Было показано, что они действуют как барьер, предотвращая вторжение гетерохроматина в центральный домен ( Scott et al., 2006 ).
