Модификации хроматина и ДНК у Arabidopsis, опосредованные RNAi
Механизм, посредством которого RNAi направляет модификации гетерохроматина у растений, сходен с таковым у дробянковых дрожжей, хотя имеются и многочисленные отличия. Наиболее важное отличие заключается в том, что у растений метилированная ДНК имеется во многих репрессивных районах гетерохроматина: в этом отношении они напоминают позвоночных, но отличаются от червей и Drosophila ( Lippman and Martienssen, 2004 ). Четыре цикла генетического скрининга, направленного на отбор мутантов с ослабленным TGS , опосредованным РНК, выявили мутантов по HKMTs , специфичным к НЗК9, и по компонентам RNAi, но они также вскрыли необходимую функцию ДНК-метилтрансфераз, SWI / SNF -комплексов ремоделинга и новую РНК-полимеразу ( Baulcombe, 2004 ). Этот скрининг детально описан в главе " Эпигенетическая регуляция у растений ", но здесь мы кратко сравним этот механизм у дробянковых дрожжей и у растений.
Для каждого скрининга на мутанты сайленсинга использовались инвертированные повторы, введенные в trans-конфигуpaцию, чтобы индуцировать сайленсинг эндогенных или трансгенных репортерных генов. Ослабление сайленсинга указывает на мутацию, возникшую в некоем необходимом компоненте пути, ведущем к сайленсингу. Использованными при этом эндогенными генами были PAI2 (участвует в биосинтезе аминокислот) ( Mathieu and Bender, 2004 ) и SUPERMAN (транскрипционный фактор, регулирующий развитие цветка) ( Chan et al., 2004 ), и эти репортерные гены управлялись либо сильным вирусным промотором, либо сильным промотором, специфичным для семени ( Matzke et al., 2004 ). В каждом случае промотор был мишенью для сайленсинга, в некоторых случаях вместе с остальной частью данного гена. Ряд генов, найденных в результате этих экспериментов по скринингу, проиллюстрирован на рис. 8.6 (см. также табл. 9.1 ). Был идентифицирован лишь один мутант по RNAi (в одном из циклов скрининга), и это был ген AG04 (аргонавт) . Однако в трех циклах скрининга были обнаружены мутанты по ДНК-метилтрансферазам, в том числе МЕТ1 и СМЕТЗ . Третья ДНК-метилтрансфераза, родственная DNMT3 млекопитающих, была идентифицирована методом обратной генетики, поскольку эта активность кодируется DRM1 и DRM2 , двумя избыточными генами, которые невозможно определить в ходе скрининга одиночных мутантов (глава " Эпигенетическая регуляция у растений "). И в самом деле, избыточность может объяснить невозможность обнаружить дополнительне компоненты аппарата RNAi: например, хотя DCL3 (DICER-LIKE 3) и RNA-DEPENDENT RNA POLYMERASE 2 ( RDRP ) преимущественно требуются для производства siRNA размером 24 нуклеотида , ассоциированной с транспозонами и повторами, по меньшей мере два других гена DCL у Arabidopsis могут в некоторой степени замещать DCL3 ( Gasciolli et al., 2005 ).
Среди других мутантов, обнаруженных при скрининге PAI2 , были мутанты по гену KYP/SUVH4 (гену НЗК9-метилтрансферазы) и содержащему хромодомен гену СМТЗ (гену ДНК-метилтрансферазы). Параллели с дробянковыми дрожжами в этом случае поражают, поскольку комплекс RITS содержит как белок Argonaute , так и хромодоменный белок Chp1 , который для своей ассоциации с хромосомой зависит от метилирования НЗК9. Однако, в отличие от дробянковых дрожжей, у Arabidopsis утрата СМТЗ или H3K9me2 не приводит к потере siRNA ( Lippman et al., 2003 ), и еще неясно, формируют ли эти белки комплекс с AG04. У Arabidopsis имеются, однако, несколько других HKMTs , специфичных к НЗК9; по крайней мере три из них обладают генетической функцией, так что и здесь избыточность может частично объяснять ситуацию ( Ebbs et al., 2005 )
Мутанты по другим ДНК-метилтрансферазам, МЕТ1 и DRM1 / DRM2 , в противоположность мутантам по СМТЗ, приводят к утрате накопления siRNA, по крайней мере, с некоей подгруппы транспозонов и с тандемных повторов, которые обычно продуцируют siRNA, если они транскрибируются ( Martienssen, 2003 ). В этих случаях утрата siRNA скоррелирована с потерей НЗК9mе2 ( Cao et al., 2003 ; Lippman et al., 2003 ). Мутанты по ATФ-азе DDM1 (decreased DNA methylation) SWI2 / SNF2 -ремоделинга хроматина также ликвидируют накопление siRNA и H3K9me2 с большой группы транспозонов, хотя в тех случаях, когда siRNA сохраняется, сохраняется и H3K9me2 ( Lippman et al., 2003 ). Возможно поэтому, что siRNA у растений связана с хромосомой через метилированную ДНК вместо связывания (или в дополнение к связыванию) через метилированные гистоны, как это имеет место у S. pombe ( рис. 8.7 ).
DDM1 обладает сильно выраженной специфичностью к транспозонам и повторам и должна как-то распознавать их как последовательности, отличные от генов. siRNA, возможно связанная с хромосомой с помощью метил-связывающих белков, могла бы обладать необходимой специфичностью для такого разграничения. В соответствии с этой идеей, транспозоны и повторы у Arabidopsis являются основным источником siRNA размером 24 нуклеотида и некоторых siRNA размером 21 нуклеотид ( Lippman et al., 2004 ). Центромерные сателлитные повторы, расположенные в виде десятков тысяч тандемных копий по обе стороны каждой центромеры, также транскрибируются и процессируются RNAi ( рис. 8.6 ). Этот процессинг зависит от DCL3 , RDR2 и DDM1 . Сайленсинг также зависит от НЗК9mе2 и СМТЗ . Однако сайленсинг здесь более сложный, чем у дробянковых дрожжей, поскольку ретротранспозонные вставки в эти повторы могут сайленсировать их, а это зависит от других механизмов с участием МЕТ1 , DDM1 и деацетилазы гистонов HDA6 ( May et al., 2005 ).
Как упоминалось выше, у дробянковых дрожжей субъединицы РНК-полимеразы II ( RNA Pol II ) необходимы для сайленсинга и производства siRNA , что говорит в пользу идеи, согласно которой аппарат RNAi и модификации хроматина рекрутируется к хромосомам с помощью вновь синтезируемых транскриптов ( рис. 8.5 ). У Arabidopsis две субъединицы новой РНК-полимеразы ( RNA pol IV ) были обнаружены в ходе одного из четырех выше упоминавшихся скринингов ( Kanno et al., 2005 ), но сначала были изолированы как слабые мутанты по PTGS , наряду с мутантами по РНК-зависимой РНК-полимеразе ( Herr et al., 2005 ). Пока еще не известно, какая матрица используется RNA pol IV, но предположили ( Vaughn and Martienssen, 2005 ), что это могут быть и метилированная ДНК ( Onodera et al., 2005 ), и двунитевая РНК. Только самые крупные субъединицы уникальны для RNA pol IV , которая, как предполагается, использует тот же набор малых субъединиц, что и RNA pol II . Дополнительные SWI2 / SNF2 -peмoдeлepы хроматина, которые также были обнаружены в ходе этих опытов по скринингу, могут изменять локальную структуру хроматина и облегчать процессивность RNA pol IV ( Kanno et al., 2004 ). Сходную роль можно предположить для DDM1 , хотя потребность для DDM1 (которая также является ремоделером хроматина) в сайленсирующих транспозонах гораздо более жесткая, чем у RNA pol IV или других белков SWI2/SNF2.
Гены могут быть эпигенетически сайленсированы близлежащими транспозонами; важным примером этого у Arabidopsis является импринтированный гомеобоксный ген FWA ( Kinoshita et al., 2004 ). Первые два экзона этого гена являются некодируюгцими и образуют тандемный повтор благодаря древней вставке элемента SINE в этот сайт ( Lippman et al., 2004 ). У мутантов по met1 (т.е. ДНК-метилтрансферазе) siRNAs, синтезированные с элемента SINE, утрачены, и этот ген в меристеме соцветия обнаруживает сильную ап-регуляцию, что приводит к позднему цветению. Такой фенотип не наблюдается у мутантов по RNAi, даже тогда, когда siRNA утрачены. Вместо этого RNAi может играть роль в инициации сайленсинга FWA, потому что трансгены FWA быстро сайленсируются, когда впервые вводятся в растение, и этот сайленсинг зависит от DCL3 , RDR2 и AG04 ( Chan et al., 2004 ). Сайленсинг мог бы затем поддерживаться метилированием ДНК, регулируемым МЕТ1. Подобным же образом аллели FWA, характеризующиеся поздним цветением, стабильно наследуются в бэккроссах после удаления с фона мутантов met1 или ddm1, поскольку поддержание эпиаллелей является наследуемым ( Soppe et al., 2000 ).
Наконец, возможно, что при некоторых обстоятельствах miRNA могут направлять метилирование ДНК генов. У Arabidopsis miRNA 165 и 166 делают иРНК с гена PHABULOSA мишенью для расщепления, и сам этот ген метилируется "вниз по течению" от участка, который соответствует miRNA по последовательности. Интересно, что это соответствие распространяется на место присоединения экзона, так что сплайсированная РНК должна взаимодействовать с miRNA, если она "направляет" метилирование ( Bao et al., 2004 ). Однако другие члены того же семейства генов не метилируются таким образом, как и большинство других генов, являющихся "мишенями" для miRNA ( Martienssen et al., 2004 ; Ronemus and Martienssen, 2005 ). Наоборот, метилируются несколько других генов в геноме Arabidopsis, обычно на их З'-конце, с помощью механизма, для которого нужен МЕТ1, но не нужен DDM1 ( Lippman et al., 2004 ; Tran et al., 2005 ). Остается посмотреть, участвует ли в этих случаях РНК.
