Мозаичный фенотип генов Drosophila, соседних с гетерохроматином
Гены, оказывающиеся в ненормальном соседстве с гетерохроматином, обнаруживают мозаичный фенотип.
Большие сегменты эукариотического генома, в основном повторяющиеся последовательности, упакованы в постоянно неактивной форме как конститутивный гетерохроматин . Эта фракция хроматина была исходно идентифицирована как та часть генома, которая остается конденсированной и интенсивно окрашивающейся ( гетеропикнотической ), по мере того, как клетка переходит от метафазы к интерфазе; такой материал обычно ассоциирован с теломерами и перицентромерными районами хромосом. Гетерохроматиновые районы обнаруживают тенденцию к поздней репликации и демонстрируют лишь незначительную мейотическую рекомбинацию или даже вовсе никакой. Эти районы бедны генами, но не лишены их вовсе, и те гены, которые там есть, для своей оптимальной экспрессии часто зависят от этой среды.
Около одной трети генома Drosophila считается гетерохроматиновой, включая целую Y-хромосому, большую часть маленькой четвертой хромосомы, перицентромерные 40% Х-хромосомы и перицентромерные 20% больших аутосом. Мы узнали уже очень многое о биохимии гетерохроматина, и многие из этих сведений получены в исследованиях, опубликованных Richards and Elgin, 2002 и Schotta et al., 2003 .
Одной из первых мутаций, идентифицированных у D. melanogaster, была мутация white - мутация, результатом которой оказывается белая окраска глаз мухи, а не характерная для них красная пигментация. Используя Х-лучи в качестве мутагена, Меллер ( Muller, 1930 ) наблюдал необычный фенотип, при котором глаз был мозаичным, с участками красных и участками белых фасеток ( рис. 5.1 ). Этот фенотип заставлял думать, что сам ген white не поврежден - в конце концов, некоторые фасетки оставались красными, и даже можно было получить мух-ревертантов с полностью красными глазами, вновь используя Х-лучи как мутаген. Однако ген white был несомненно сайленсирован в некоторых клетках, в которых он экспрессируется в норме. Последующие исследования политенных хромосом (представлены ниже, см. рис. 5.4 ) показали, что такие фенотипы были следствием инверсии или перестройки, когда одна точка разрыва находилась в пределах перицентромерного гетерохроматина, а другая - вблизи гена white ( рис. 5.1 ). Поскольку причина такого мозаичного фенотипа - в изменении положения гена в пределах хромосомы, это явление называется эффектом положения мозаичного типа ( PEV ). У Drosophila было показано, что по существу каждый ген, который был изучен в соответствующей перестройке, проявляет мозаицизм, и перестройки, включающие перицентромерный гетерохроматин любой хромосомы, могут приводить к PEV. PEV наблюдали у ряда организмов, в том числе у дрожжей, мух и млекопитающих, но как инструмент для изучения формирования гетерохроматина он был использован в основном у Drosophila.
PEV показывает, что такие перестройки позволяют упаковке в гетерохроматиновую конфигурацию "распространяться" вдоль по длине хромосомы. Все выглядит таким образом, как если бы перестройка удалила существующий в норме барьер или буферную зону. Следствием этого является измененная упаковка и сайленсинг генов, в норме организованных в эухроматиновой форме. Визуальное обследование политенных хромосом личинок, несущих такую перестройку, показывает, что район, несущий репортерный ген, упакован теперь в плотный блок гетерохроматина, но только в тех клетках, в которых этот ген неактивен ( Zhimulev et al., 1986 ). Картина, наблюдаемая вследствие перестройки white, может варьировать по числу пигментированных клеток, величине пигментированных пятен и уровню содержания пигмента в наблюдаемых двух разных клеточных типах ( рис. 5.1 ). В системе, использующей в качестве репортера индуцибельный ген lac-Z , исследователи наблюдали, что сайленсинг происходит в эмбриогенезе (когда впервые цитологически наблюдается гетерохроматин ) и эпигенетически наследуется как в соматической, так и в зародышевой линиях; мозаичный фенотип был определен в ходе дифференцировки по мозаичной релаксации сайленсинга у личинок третьего возраста ( Lu et al., 1996 ). Однако не все гены, обнаруживающие мозаицизм, остаются "молчащими" до периода после дифференцировки, и для разных генов баланс факторов, приводящий к решению "включить/выключить", несомненно различен (дополнительное детальное обсуждение см. Ashburner et al., 2005b ).
При наличии мух, имеющих PEV-фенотип, довольно просто провести скрининг на доминантные мутации во втором сайте (индуцированные химическими мутагенами, вызывающими точечные мутации или мелкие инсерции/делеции), которые либо являются супрессорами PEV (обозначаются Supressor of variegation, Su[var] ) и приводят к утрате сайленсинга, либо являются энхансерами PEV (обозначаются Enhancer of variegation, E[var] ), приводящими к усилению сайленсинга ( рис. 5.1 ). Изолировали и охарактеризовали около 30 модификаторов PEV, но на основе такого скрининга можно предсказать существование значительно большего числа кандидатов на эту роль. Там, где такой ген был клонирован, а его продукт охарактеризован, обычно обнаруживают хромосомный белок или модификатор хромосомного белка. Небольшая выборка этих локусов вызывает как гаплоаномальный, так и триплоаномальный фенотип; т.е. если одна копия гена приводит к супрессии PEV, три его копии приводят к усилению PEV.
Идентификация таких локусов привела к предположению, что белковые продукты этих генов играют структурную роль в гетерохроматине и что распространение гетерохроматиновой упаковки может управляться дозой этих белков в стохастическом режиме ( рис. 5.2 ) ( Locke et al., 1988 ). Однако "распространение" является не простым линейным континуумом, а сложным процессом, который, вероятнее всего, зависит от организации ДНК в том районе, который сайленсирован (см. ниже).
Результаты, наблюдаемые по перестройкам хромосом, заставляют предполагать, что эухроматиновый ген, в результате транспозиции вставленный в гетерохроматиновый район, также будет обнаруживать мозаичный фенотип. Так оно и оказалось. Для этой цели можно подвергнуть генноинженерным манипуляциям P-элемент - ДНК-транспозон, обнаруживамый во многих природных линиях Drosophila. Природный P-элемент имеет на каждом конце особые инвертированные повторяющиеся последовательности и кодирует всего лишь один фермент - P-специфическую ДНК-транспозазу . Репортерные конструкты, лишенные ДНК-транспозазы, но содержащие другие гены, представляющие интерес для исследователя, можно вставить в геном Drosophila в присутствии активной транспозазы путем их совместной инъекции в эмбрионы Drosophila. Мобильный элемент на основе Р (такой, как показано на рис. 5.3 а), несущий управляемую hsp70 копию white, можно использовать в мухах, лишенных эндогенной копии white, чтобы идентифицировать домены гетерохроматина. Когда Р-элемент вставляется в эухроматин, муха имеет красные глаза. Когда же этот Р мобилизуется (путем встраивания в ген, кодирующий транспозазу), приблизительно 1% выявляемых линий обнаруживают мозаичный фенотип глаз. Гибридизация in situ показывает, что в этих случаях Р-элемент перескочил в перицентромерный гетерохроматин, теломеры или небольшую четвертую хромосому ( Wallrath and Elgin, 1995 ). Эта идентификация гетерохроматиновых доменов согласуется с более ранними цитологическими исследованиями.
Использование таких Р-элементов позволило сравнить упаковку одного и того же репортерного гена в гетерохроматиновом и эухроматиновом окружении. Гетерохроматин относительно устойчив к расщеплению нуклеазами, как неспецифическими (например, ДНКаза I), так и специфическими (рестрикционные энзимы), и менее доступен для других экзогенных зондов, таких как метилтрансфераза dam . Анализ одного и того же трансгена hsp26 (маркированного фрагментом уникальной растительной ДНК, рис. 5.3 а) в эухроматине и в перицентромерном гетерохроматине с использованием микрококковой нуклеазы (MNase) выявил сдвиг в сторону более упорядоченного расположения нуклеосом в гетерохроматине ( рис. 5.3 б,в). Фрагменты, полученные путем расщепления ферментом MNase , четко определены, что позволяет предполагать наличие меньшей, чем обычно, мишени для MNase в линкерном районе. Упорядоченное расположение нуклеосом простирается на весь 5'-регуляторный район гена; этот сдвиг несомненно обусловливает наблюдаемую потерю 5'-гиперчувствительных (HS) сайтов ( Sun et al., 2001 ). Действительно, хотя механизм сайленсинга понят еще не полностью, имеются многочисленные данные о транскрипционной репрессии сильно мозаичных генов, включая утрату связывания TFIID и других транскрипционных факторов ( Cryderman et al., 1999b ).
