Каспазы в Fas-индуцированном апоптозе
Генетический анализ программированной клеточной смерти у нематоды Caenorhabditis elegans выявил ряд факторов, регулирующих процесс клеточной гибели [ Ellis R.E., 1991 ]. Как оказалось, один из этих факторов, а именно CED-3 , необходим для гибели клеток. Молекулярное клонирование гена CED-3 показало его гомологию с протеазой ICE (interleukin-1beta-converting enzyme) из млекопитающих [ Yuan J., 1993 ]. ICE превращает предшественник интерлейкина-1бета (IL-1бета) в зрелую форму. ICE - цистеиновая протеаза, состоящая из двух больших ( р17 ) и одной малой ( р10 ) субъединиц, которые являются продуктами протеолитического расщепления предшественника ICE - зимогена . В геноме человека идентифицировано, по меньшей мере, десять гомологов ICE, которые можно разделить на три подгруппы на основании гомологии их последовательностей: ICE -подобные, СРР32 -подобные и ICH-1 -подобные протеазы [ Alnemri E.S., 1996 ]. Все они относятся к цистеиновым протеазам и при повышенной экспрессии вызывают в клетках апоптоз. Все они содержат также консервативные последовательности участков связывания и катализа субстрата и расщепляют свои субстраты после аспарагиновой кислоты . Сейчас они называются "каспазы" (cysteine aspases) [ Nagata S. 1997 ].
Установлено, что каспаза-1 (ICE) распознает последовательность Tyr-Val-Ala-Asp ( YVAD ) в предшественнике IL-1бета и расщепляет его, каспаза-3 (CPP32/Yama/apopain) распознает последовательность Asp-Glu-Val-Asp ( DEVD ) и расщепляет поли-АДФ-рибозилполимеразу, а каспаза-6 (Mch2) узнает последовательность Val-Glu-Ile-Asp ( VEID ) и расщепляет ламин [ Nicholson D.W., 1995 , Takahashi A., 1996 ].
Тем не менее пока не ясно: имеет ли каждая протеаза специфический субстрат для выполнения своей проапоптотической функции, или некоторые из членов этого семейства дублируют друг друга, расщепляя одни и те же субстраты. В соответствии с этим не будет лишним заметить, что мыши, лишенные каспазы-1 , не проявляют фенотипа какого-либо нарушения программированной клеточной гибели [ Li P., 1995 ], хотя у мышей, дефицитных по каспазе-3 , наблюдали гиперплазию и расстройство клеточного развития мозга [ Kuida K., 1996 ].
Проведенные исследования позволяют предположить, что каспаза-1 является резервной во всех типах клеток, тогда как каспаза-3 играет основную роль в апоптозе некоторых клеток мозга.
Знание специфических последовательностей опознавания субстратов протеазами IСЕ-семейства позволило создать специфические конкурентные ингибиторы и флуоресцентные субстраты для каспазы-1 и каспазы-3 [ Thornberry N.A., 1992 ]. Некоторые белки, кодируемые вирусными генами, ингибируют каспазы , например, CrmA-белок - продукт гена-модификатора ответа на цитокины, кодируемый вирусом коровьей оспы , и белок бакуловируса р35 . Как оказалось, эти вирусные белки ингибируют активность протеаз, образуя с ними стабильный комплекс. Белок р35 обладает менее специфичным действием, чем CrmA . Таким образом, CrmA предпочтительнее ингибирует каспазу-1 , чем каспазу-3 , тогда как р35 ингибирует каспазу-1 и каспазу-3 одинаково.
Ингибиторы каспазы-1 и каспазы-3 блокируют и Fas -, и TNFR1 - индуцированный апоптоз, поэтому можно сделать предположение, что и каспаза-1, и каспаза-3 вовлечены в оба процесса [ Enari M., 1995 , Enari M., 1996 , Los M., 1995 , Tewari M., 1995 ]. Мониторинг протеазной активности со специфическими флуоресцентными субстратами для каспазы-1 и каспазы-3 показал, что каспаза-1 постоянно активирована, тогда как активность каспазы-3 постепенно возрастает во время Fas-индуцированного апоптоза [ Enari M., 1996 ]. Сходная последовательная активация каспаза-1- и каспаза-3-подобных протеаз была также обнаружена in vivo. При введении агонистических МА к Fas у мышей повреждалась печень [ Ogasawara J., 1993 ]. В процессе повреждения печени наблюдали постоянную каспаза-1-подобную активность, сопровождающуюся постепенно возрастающей активностью каспаза-3-подобных протеаз. Активация каспаза-3-подобных протеаз зависит от активации каспаза-1-подобных протеаз [ Enari M., 1996 ].
Таким образом, протеазы в процессе апоптоза активируются последовательно. Эта последовательная активация наблюдается и в бесклеточной системе. Так, содержимое лизированных клеток, активированных МА к Fas, но не содержимое лизированных нормальных растущих клеток, индуцирует апоптотические морфологические изменения в интактных ядрах [ Enari M., 1995 ]. Содержимое лизированных растущих клеток после добавления к нему рекомбинантных каспазы-1 или каспазы-3 вызывает в клетках апоптоз. Каспаза-1-индуцированный апоптоз подавляется не только ингибиторами каспазы-1, но и ингибиторами каспазы-3 [ Enari M., 1996 ], что подтверждает последовательную активацию каспаза-1- и каспаза-3- подобных протеаз при передаче сигнала.
Вероятно, что и другие протеазы ICE-семейства последовательно активируются при апоптозе, вовлекая все новых представителей семейства в этот процесс. Последовательную активацию протеаз ICE-семейства при Fas- индуцированном апоптозе можно образно назвать "каскадом протеаз". "Каскад протеаз" обеспечивает расщепление жизненно важных для клетки субстратов, таких, как ламин , актин , поли-АДФ-рибозилполимераза , ДНК- зависимые протеинкиназы и др., и вызывает апоптотические морфологические изменения в ядрах клеток и деградацию хромосомной ДНК.
Олигомеризация Fas активирует каспазу-8 , которая относится к каспаза-3 -подобным протеазам. Возникает вопрос, каким образом этот факт согласуется с моделью последовательной активации протеаз? Можно предположить, что олигомеризация каспазы-8 через взаимодействие с FADD/MORT1 приводит к ее автокаталитической активации и затем cамоактивированная каспаза-8 запускает каскад протеаз, расщепляя каспаза-1-подобную протеазу - зимоген . Возможен и другой вариант, при котором олигомеризация каспазы-8 не приводит к ее автокатализу, но каспаза-1-подобная протеаза активирует олигомеризованную каспазу-8 и затем активная каспаза-8 последовательно активирует протеазы IСЕ-семейства .
В дополнение к протеазам ICE-семейства, другие протеазы, такие, как катепсин Д и сериновая протеаза AP24 (апоптозная протеаза 24) , могут быть вовлечены в Fas - и TNFR1 -индуцированный апоптоз. Однако неясно, каким образом эти протеазы задействованы в процессе апоптоза.
