Механизм инактивации гена посредством ДНК-метилирования
Механизм инактивации гена посредством ДНК-метилирования только начинает проясняться. В настоящее время принята гипотеза, что белок MeCp2 (methylated-DNA binding protein 2) связывается с метилированной ДНК и включается в белковый комплекс, состоящий из гистоновых белков, деацетилазы и др. Этот белковый комплекс, в свою очередь, инициирует компактизацию хроматина, что не дает связаться факторам тракскрипции с промоторной областью и, следовательно, происходит инактивация гена ( Jones et al. 1998 ).
ДНК-метилирование - физиологический процесс, который контролирует эпигенетическое наследование и экспрессию генов. Но этот процесс может быть нарушен и аберрантное метилирование CpG-островков является одной из причин, лежащих в основе изменений, наблюдаемых при старении и образовании раковых клеток .
Первые два гена, для которых было показано аберрантное метилирование, были кальцитонин и MyoD ( Jones, 1999 ). Функциональное значение этого явления ранее было неясно, поскольку оба гена не экспрессируются в большинстве тканей. Открытие привело к гипотезе, что метилирование промотора может быть одним из механизмов инактивации генов-супрессоров опухолевого роста в раковых клетках. Предположение было вскоре подтверждено обнаружением метилирования промоторной области известных генов-супрессоров опухолевого роста типа гена Rb1 , гена VHL и гена p16 в спорадических опухолях.
В настоящее время список генов, инактивирующихся метилированием промоторной области, пополняется. Так было показано аномальное биаллельное метилирование промотора гена Н19 у пациентов с опухолью Вильмса . Также показано метилирование промоторной района р16 во многих типах опухолей. В гепатокарциномах и аденокарциномах поджелудочной железы инактивация гена таким способом происходит почти в 70% случаев. Гиперметилирование промоторной области рецептора эстрогена (ER) обнаруживается в опухолях толстого кишечника ( Issa et al. 1994 ). Транскрипционный фактор (MYOD) , специфичный для мышечной ткани, гиперметилируется не только при раке мочевого пузыря , но и при раке толстого кишечника . Клонированный ген N33 подвергается метилированию в том же типе опухолей, как и два других гена ( ген ER и ген MYOD ), более чем в 90% случаев ( Ahuja et al. 1998 ). Тканевой ингибитор металлопротеиназы-3 (TIM-3) может подавлять рост опухоли, ангиогенез , прорастание и метастазирование. Показано, что аберрантное метилирование промоторного района этого гена происходит в различных опухолях: при немелкоклеточном раке легкого в 19%, раке молочной железы в 27%, раке толстой кишки в 27%, карциноме почки в 78% и глиобластоме в 26% случаев. В спорадических опухолях молочной железы обнаруживают инактивацию посредством метилирования гена BRCA1 , гена MYOD и гена ER ( Dobrovic et al. 1997 , Ahuja, 1998 , Lapidus, 1998 ).
Таким образом, метилирование промоторной области может являться новым механизмом инактивации генов-супрессоров опухолевого роста.
Роль метилирования ДНК в генезе опухолей была изучена на примере гена MНL1 , который ответственен за развитие рака желудочно-кишечного тракта . В клетках опухоли выявляется большое количество генетических изменений - микросателлитные маркеры представлены одновременно многими разными аллелями, дополнительными к двум родительским аллелям. Это явление получило название "нестабильности микросателлитов" (MSI) или "репликационных ошибок". Этот ген имеет гиперметилированный промоторный район. Обработка клеток опухоли метилтрансферазой, ингибирующей 5-аза-2'-деоксицитидин (5-azad-2'-C) приводила к деметилированию промотора MHL1, выработке MHL1-белка и восстановлению активности гена, вследствие чего опухоль претерпевала обратное развитие.
Таким образом, было установлено, что гиперметилирование CpG-островков является ведущим в механизме инактивации MHL1.
Точное или даже приблизительное количество генов, чья промоторная область гиперметилирована в опухолевых клетках, неизвестно. Трудности количественной оценки в том, что метилирование в клеточных линиях отличается от метилирования в нормальных тканях и опухолевых клетках организма, а также метилированию в различных опухолевых клетках подвергаются разные гены. В опухолях наиболее надежным методом для оценки частоты метилирования CpG-островков в настоящее время считается метод RLGS (restriction landmark genomic scanning). Используя этот метод, было показано, что в раковых клетках метилировано примерно 1-2% CpG-островков. Эти результаты, скорее всего, занижены, т.к. образцы опухолевой ткани очень часто бывают загрязнены нормальной (неопухолевой) тканью.
Была проведена оценка частоты метилирования CpG-островков на 10 случайно отобранных генах в нескольких клеточных линиях. Частота метилирования в этих клетках составила 10-40%. Используя другие методы исследования, частота метилирования на этих же образцах, была оценена как 40-50%. Но независимо от используемого метода становится ясно, что в раковых клетках несколько тысяч CpG-островков метилировано. Остается только выяснить, сколько из них связаны с подавлением транскрипции гена, и какие из них вносят вклад в жизнедеятельность клетки.
Основными методами, применяемыми для определения метилирования CpG-островков, являются:
- использование метилчувствительных рестриктаз (HpaII, HhaI, NotI, SacII, EagI, BssHII и др) с последующей амплификацией CpG-островка и,
- бисульфитная модификация ДНК с последующей метил-специфической амплификацией или секвенированием. Метод основан на том, что бисульфит натрия преобразовывает все неметилированные цитозины в урацил, в то время как метилированные цитозины, стоящие перед гуанином остаются в немодифицированном состоянии.
