Гамма-секретазный комплекс
Вскоре после того, как белок пресенилин был первично охарактеризован ( Thinakaran, 1996 ), было показано, что N- и С- концевые фрагменты белка PS образуют гетеродимеры, входящие в состав высокомолекулярного мембранного комплекса 100-250 кД ( Capell, 1998 ; Yu, 1998 ). При этом пресенилины PS1 и PS2 образуют независимые комплексы, близкие по размерам ( Yu et al., 1998 ). Уровень процессированных форм N- и C-концевых фрагментов PS1 и PS2 координированно регулируется неизвестными лимитирующими клеточными факторами ( Thinakaran, 1997 ).
Гетеродимеры пресенилина 1 обнаруживаются в белковой высокомолекулярной фракции, для которой показана гамма-секретазная активность ( Li, 2000,a ). Меченые ингибиторы гамма-секретазной активности, копирующие конфигурацию связи субстрата с аспартатным каталитическим центром, связывались с гетеродимерами пресенилина 1 ( Esler, 2000 ; Li, 2000,б ). Все эти данные, вместе со свидетельствами участия пресенилинов в протеолизе Notch и APP , позволили определить гетеродимер пресенилина как первый и главный компонент гамма-секретазного комплекса ( табл. 3 ).
При помощи иммунопреципитации внутриклеточных мембранных фракций HEK293 антителами к N-концевой части белка PS1, был выделен белок комплекса, названный никастрином (Nct) ( Yu, 2000 ).
Мыши, нокаутированные по Nct (Nct-/-), имели фенотип, копирующий фенотип нокаутов по PS1, PS2 или по гену Notch1. В культурах клеток фибробластов, нокаутированных по никастрину, не проходил гамма-/S3 протеолиз APP и Notch, и, кроме того, шло накопление непроцессированной формы пресенилина ( Li T., 2003 ; Li J., 2003 ). Такие же результаты получены при ингибировании Nct с помощью дцРНКи в культуре клеток HEK293 ( Edbauer, 2002 ). Таким образом, установлено, что никастрин является важным компонентом гамма-секретазного комплекса, необходимым для стабилизации процессированных гетеродимеров пресенилина. И наоборот, пресенилин регулирует включение никастрина в комплекс, что было показано на фибробластах, нокаутированных по PS1, PS2 генам ( Edbauer, 2002 ).
Ко-экспрессия пресенилина и никастрина в клеточных культурах, как и гипер-экспрессия одного пресенилина, не приводила к усилению активности гамма-секретазы, на основании чего было сделано предположение, что в клетке существуют еще дополнительные факторы, лимитирующие такую активность ( Kimberly, 2002 ).
В результате массового скрининга мутантов C. elegans , приводящих к Notch/glp-1 фенотипу (летальных мутантов с материнским эффектом и эмбриональной гибелью потомства, имеющего недоразвитие передней части глотки) помимо aph-2 , был выделен aph-1 ген (anterior pharynx defective 1) ( табл. 3 ; Goutte, 2002 ). В параллельном скрининге мутаций, усиливавших эффект sel-12 и hop-1 мутантов, и приводящих к Notch/glp-1 фенотипу, были обнаружены мутации в уже известных генах aph-2, aph-1 (другое название-синоним pen-1 - presenilin enchancer 1), и в новом - pen-2 гене (presenilin enchancer 2) ( табл. 3 ; Francis, 2002 ). Было показано, что APH-1 и PEN-2 являются критически необходимыми белками для осуществления гамма-/S3 протеолиза APP и Notch в культуре клеток D. melanogaster и млекопитающих ( Francis, 2002 ; Lee, 2002 ).
У человека обнаружно два гомолога aph-1 - APH-1A и APH-1B , кодирующих политопные белки с семью трансмембранными доменами, содержащие 251 и 257 ак соответственно. Белок PEN2 человека состоит из 101 ак, содержит два трансмембранных домена. С- и N- концы PEN2 направлены в межклеточное пространство. APH-1 и PEN2 белки связываются с пресенилином и Nct , и регулируют процессинг пресенилина ( Francis, 2002 ; Lee, 2002 ; Gu, 2003 ; Luo, 2003 ; Takasugi, 2003 ). При ингибировании активности PEN2 в клетках N2а нейроглиомы мыши, HeLa человека, S2 и нейрональных BG2 клетках дрозофилы и др. с помощью дцРНКи, происходило накопление полноразмерной формы PS1. Гиперэкспрессия PEN2 усиливала эндопротеолиз PS1, особенно при совместной экспрессии с другими факторами ( Luo, 2003 ; Takasugi, 2003 ).
Роль каждого из кофакторов, компонентов гамма-секретазного комплекса интенсивно изучается. Так, показано, что APH-1 может участвовать в созревании комплексов пресенилина с никастрином ( Gu, 2003 ). APH-1 подвергается по крайней мере трем эндопротеолитическим расщеплениям, одно из которых индуцируется экспрессий Nct, при этом образуется С-концевой фрагмент, который связывается с Nct ( Fortna, 2004 ).
Определено, что только при совместной экспрессии всех четырех белков (PS, Nct, APH-1, PEN2) в культурах клеток происходит усиление гамма-секретазной активности ( Takasugi, 2003 ). Удалось воссоздать активный гамма-секретазный комплекс при ко-эспрессии PS, Nct, APH-1, PEN2 в клетках E. coli, в которых не найдено гомологов этих белков и отсутствует эндогенная гамма-секретазная активность. Интересно, что эндопротеолиз пресенилина в клетках E. coli, также можно было вызвать только ко-экспрессией всех четырех белков комплекса ( Edbauer, 2003 ). Кроме того, активный гамма-секретазный комплекс был очищен, и, на основании масс-спектрометрического анализа и результатов ко-иммунопреципитации, были определены необходимые и достаточные компоненты комплекса - гетеродимеры PS, Nct, APH-1 и PEN2. Для выделения комплекса использовали стабильно трансфицированные генами PS1, mNct, APH-1, PEN 2 клетки китайского хомячка CHO ( Fraering, 2004 ).
