Замещение гистоновым вариантом HЗ.З в активном хроматине
Замещение гистоновым вариантом НЗ.З обнаруживается в активном хроматине.
Полагают, что транскрипционно активный хроматин, подобно центромерам , поддерживается эпигенетически и, подобно центромерам, активный хроматин обогащен вариантом гистона НЗ, называемым НЗ.З ( Henikoff and Ahmad, 2005 ). НЗ.З очень похож по последовательности на канонические формы НЗ, отличаясь лишь четырьмя аминокислотами. При таких маленьких различиях можно было бы предположить, что эти две формы взаимозаменяемы. Однако у Drosophila НЗ.З откладывается путем либо RC -, либо RI -сборки, тогда как НЗ откладывается толко в репликационных фокусах RC-способом. Это различие между двумя вариантами закодировано в самом белке, причем три из четырех различий между НЗ и НЗ.З явно участвуют в предотвращении откладки НЗ по способу RI (в альфа-спирали 2, рис. 13.2 ). Очистка растворимых комплексов сборки у человека подтвердила, что эти две формы участвуют в разных процессах сборки: Н3.1 выделялся совместно с CAF-1 для RC-сборки, а НЗ.З выделялся вместе с другими компонентами, в том числе с HirA , и участвовал в RI-сборке.
Хотя различия по четырем аминокислотам могли бы показаться практически несущественными, но если учесть, что человек, мухи и двустворчатые моллюски обладают НЗ.З , имеющими в точности одинаковую последовательность, эти отличия от НЗ становятся заметными. Филогенетический анализ показывает, что пара НЗ/НЗ.З возникала в разное время в ходе эволюции эукариот по меньшей мере четыре раза: у растений, у животных/грибов, у инфузорий и у Apicomplexa ( Malik and Henikoff, 2003 ). Несмотря на отдельное происхождение от животных и грибов, пара НЗ/НЗ.З животных и пара от растений (называемая H3.1 [RC] и H3.2 [RI] - во избежание путаницы мы обозначаем все изоформы RC как НЗ, а все изоформы RI как НЗ.З) поразительно похожи друг на друга. Один и тот же кластер аминокислот (позиции 87-90, который препятствует отложению НЗ по RI-типу у Drosophila , оказался отличающимся у растений, и другое различие у животных (в позиции 31 находится Ala у НЗ и либо Ser, либо Thr у НЗ.З) также обнаруживается у растений. Грибы особенно интересны. Исходно [ancestrally] они имеют и НЗ, и НЗ.З; однако аскомицеты , к которым относятся дрожжи и плесневые грибы, утратили форму НЗ. Таким образом, облигатная RC-форма гистона НЗ, привлекшая наибольшее внимание у животных, даже не присутствует у дрожжей.
Исследования НЗ.З в основной массе хроматина показали, что активные фракции обогащены им ( Henikoff and Ahmad, 2005 ). Однако разнообразные факторы вносили свой вклад в ситуацию неопределенности с этой потенциальной "меткой" активного хроматина во времена великого возбуждения в хроматиновой области, когда осознали, что модификации гистонов могут отличать активный хроматин от "молчащего". Прежде всего, отсутствовали какие-либо антитела, которые могли бы эффективно отличать НЗ от НЗ.З в хроматине (позиции 87-90 блокированы спиралями ДНК в нуклеосоме), тогда как превосходные антитела против многих посттрансляционных модификаций были легко доступными. Кроме того, различия по последовательности между НЗ и НЗ.З, казавшиеся незначительными, не предполагали каких-либо фундаментальных различий в хроматине, тогда как модификации гистонов были главным образом по лизинам " хвостов ", о которых было известно, что они влияют на взаимодействия хроматина или связывают ассоциированные с хроматином белки. Ощущение, что эти две формы гистона 3 должны быть взаимозаменяемыми, получило подтверждение в открытой у Tetrahymena возможности замены S-фазной формой гистона ее замещающего аналога. Наконец, влиятельная гипотеза " гистонового кода " представляла нуклеосомы как фиксированные мишени модификационных ферментов во время дифференцировки хроматина ( Jenuwein and Allis, 2001 ). Однако становилось все более и более очевидным, что хроматин является высокодинамичным, и даже ассоциированные с гетерохроматином белки связываются с местами своего нахождения на минуты или даже менее ( Phair et al., 2004 ). Оказывается, хроматин активно транскрибируемых генов находится в состоянии постоянного изменения, характеризующемся непрерывным замещением гистонов ( Henikoff and Ahmad, 2005 ). Три коровых различия, отличающие НЗ от НЗ.З, делают димеры НЗ.З*Н4 субстратом для RI -сборки, и сама по себе RI-сборка глубоко изменяет хроматин. В результате этого процесса активно транскрибируемые участки становятся маркированными НЗ.З ( рис. 13.6 ), и доказательства в пользу этого процесса следуют из наблюдения RI-замещения НЗ, метилированного по лизину 9 (НЗК9mе) меченым НЗ.З [with tagged НЗ.З] в транскрибируемых РНК-полимеразами I и II (pol I и II) локусах ( Schwartz and Ahmad, 2005 ).
Результатом динамичной природы хроматина в активных локусах является стирание предсуществовавших модификаций гистонов. Этим обеспечивается потенциальное решение вопроса о том, каким образом "молчащий" хроматин может становиться активированным, когда он гиперметилирован по НЗК9 и НЗК27 (модификации гистонов, обычно ассоциированные с репрессивным хроматином). Исследования временной динамики показали, что метилы на гистонах столь же стабильны, как и сами гистоны ( Waterborg, 1993 ), хотя открытие деметилазы, специфичной для моно- и диметилированного НЗК4 ( Shi et al., 2004 ), показывает, что некоторые метильные группы могут энзиматически удаляться с гистонов. В целом, паттерны ковалентных модификаций гистонов могли бы быть результатом модификаций, уже присутствующих на гистонах в то время, когда они откладываются. Таким путем модифицирующие ферменты шли бы по уже проложенному следу вместе с машиной сборки, возможно облегчая этот процесс ( Henikoff and Ahmad, 2005 ).
Эта модель динамической сборки предсказывает, что модификациями гистонов, которыми обогащен активный хроматин, должен быть обогащен и НЗ.З, и большинство измерений модификаций в НЗ и НЗ.З показали, что так оно и есть и у растений, и у животных. Более того, на основании этой модели ожидается, что активные модификации лизинов, такие как ацетилирование гистонов НЗ и Н4 и метилирование гистонов НЗК4 и НЗК79, будут сильно коррелировать друг с другом, как наблюдалось в разных системах ( O'Neill et al., 2003 ; Kurdistani et al., 2004 ; Schubeler et al., 2004 ). Наконец, динамическая RI -сборка в активных генах может объяснить, почему мутации CAF-1 вызывают утрату сайленсинга ( Loyola and Almouzni, 2004 ): считается, что лишь около 10% генома дрожжей находится в "молчащем" состоянии, и это, возможно, единственный хроматин, который не замещается динамически в геноме дрожжей. В отсутствие опосредуемой CAF-1 RC -сборки RI-сборка происходила бы по всему геному дрожжей, активируя прежде "молчащие" районы. Возможно, существование варианта НЗ, предназначенного для RC-сборки у многоклеточных эукариот, является адаптацией для удержания подавляющей части хроматина клетки в эпигенетически "молчащем" состоянии.
Замещение дифференциально модифицированными димерами НЗ.З*Н4 позволяет предложить простую модель наследования активного хроматина у делящихся клеток ( Henikoff and Ahmad, 2005 ). Активный хроматин оставался бы активным после разбавления обычными нуклеосомами после RC-сборки, если эта случайная смесь RI -отложенных и RC -отложенных нуклеосом не мешает таким активным процессам, как транскрипционная инициация и элонгация. Продолжение транскрипционной активности в результате восстанавливало бы хроматин в следующем клеточном цикле, приводя к постоянному поддержанию активного хроматина на протяжении всего развития. Возможность того, что вариант гистона постоянно поддерживается процессом RI-сборки, может относиться и к CenH3s , которые вставлялись бы в бреши, создаваемые "развертыванием" обычных нуклеосом в результате анафазного натяжения.
Когда клетки выходят из клеточного цикла и дифференцируются, они больше не продуцируют и не включают S-фазные гистоны, и в результате накапливается НЗ.З. Например, НЗ.З накапливается в мозге крыс до уровня, составляющего 87% от уровня гистона НЗ, ко времени достижения крысами 400-дневного возраста ( Henikoff and Ahmad, 2005 ). Имеет ли это градуальное замещение хроматина какое-нибудь функциональное значение или не имеет - неизвестно. Неизвестно также, является ли активный процесс, делающий возможным замещение, тем же самым, что и процесс, наблюдаемый в транскрипционно активных локусах. Одна из возможностей заключается в том, что разрушение хроматина проходящей РНК-полимеразой или машиной ремоделинга хроматина вызывает локальное развертывание нуклеосомы и случайную утрату димера НЗ.З*Н4 ( рис. 13.7 ). Это сопровождалось бы воссозданием [reassembly] нуклеосомы вслед за полимеразой с замещением утраченного димера димером НЗ.З*Н4 с помощью комплекса HirA . Лишь тогда, когда полимеразы упакованы слишком плотно для осуществления сборки, нуклеосомы полностью развертываются [unravel].
