ДНК: нуклеотидная последовательность, клонирование и определение
Размер, сложность организации и изменчивость генома человека затрудняют анализ индивидуальных признаков и генов. Возможности такого анализа сильно возросли с развитием методов рекомбинации ДНК, позволяющих выделять небольшие фрагменты ДНК и синтезировать их в неограниченном количестве. Уже клонированы сотни генов, например гены, мутации которых вызывают муковисцидоз , синдром Марфана , аденоматозный полипоз толстой кишки , нейрофиброматоз , атрофическую миотонию , синдром ломкой Х-хромосомы , болезнь Гентингтона , семейный рак молочной железы типа 1 , синдром Линча и многие другие.
Клонированные гены и кодируемые ими белки используют для изучения структуры и функции гена в норме и при патологии, как с исследовательскими целями, так и для диагностики, лечения и консультирования.
Клонирование заключается в выделении фрагментов ДНК, встраивании их в нуклеиновую кислоту из другого организма (так называемый вектор), что позволяет получить множество копий каждого фрагмента. В вектор можно встроить фрагмент ДНК размером от десятков до сотен тысяч нуклеотидов. Методы клонирования ДНК описаны в работе Watson J.D. et al., 1992. (см." Генетика и болезни: литература " ).
С помощью обратной транскриптазы на матрице мРНК можно синтезировать кДНК , пригодную для клонирования и анализа. Клоны кДНК (в отличие от клонов геномной ДНК) не содержат последовательностей, соответствующих интронам . Клоны геномной ДНК и кДНК выделены для сотен генов и для тысяч их фрагментов, а также для так называемых анонимных областей генома человека . Выполняющие неизвестную функцию анонимные области - это уникальные участки генома, часто содержащие полиморфные генетические маркеры. На основании полного или частичного определения нуклеотидной последовательности клонированной кДНК определяют аминокислотную последовательность белка и сравнивают с аминокислотными последовательностями известных белков.
В любой клонированный фрагмент можно ввести метку (радиоактивный изотоп, биотин и др.) и использовать его как специфический молекулярный зонд . Радиоактивные зонды выявляют с помощью радиоавтографии, а биотинилированные - с помощью меченого авидина.
Клонирование позволило получить зонды для анализа ДНК, для выявления мутаций, вызывающих заболевания, а также установить последовательность нуклеотидов в ДНК, зная которую можно определить аминокислотную последовательность в белке и приготовить праймеры для амплификации ДНК с помощью ПЦР .
