Апоптоз: дрожжи
Когда была получена полная структура генома дрожжей Saccharomyces cerevisiae [ Coffeau, ea 1996 ], в нем первоначально не было найдено гомологов ни каспаз, ни других белков, характерных для апоптоза у млекопитающих. Однако в том же году был найден мутант с явными признаками апоптоза: перераспределением фосфатидилсерина , конденсацией хроматина вдоль ядерной оболочки и фрагментацией клеток. Этот фенотип вызывала точковая мутация гена cdc48S565G , кодирующего белок, ответственный за образование везикул [ Madeo, ea 2002 ]. Делеция гена ASF1/CIA1 , кодирующего гистоновый шаперон, также приводила к апоптозу, следующему за остановкой клеточного цикла в фазе G2/M. Более того, наблюдалось снижение величины дельта-пси и выход цитохрома с из митохондрий [ Yamaki, ea 2001 ]. У дрожжей S.cerevisiae апоптоз вызывали низкие дозы Н2О2 . Ингибитор цитоплазматической трансляции циклогексимид , антиоксиданты и гипоксия предотвращали его. Эти данные позволяют думать, что генерация АФК исходно являлась ключевым событием апоптоза [ Madeo, ea 1999 ]. Стареющие материнские клетки S.cerevisiae , прошедшие более 20 почкований, сами продуцировали АФК [ Laun, ea 2001 ]. От своих молодых потомков эти клетки отличались более крупными размерами (10-15 вместо 5-7 мкм), замедленным биосинтезом белков и неровной поверхностью. Кроме того, они демонстрировали типичные признаки апоптоза - фрагментацию хроматина и перераспределение фосфатидилсерина [ Laun, ea 2001 ]. Вызывающая апоптоз обработка Н2О2 индуцировала у дрожжей каспазную активность, полностью исчезающую после нокаута гена yor197w и заметно стимулируемую при сверхэкспрессии этого гена. Продукт гена yorl97w, названный YCA1 (Yeast Caspase-1) [ Madeo, ea 2002 ], отвечает также за старение культур , тем самым подчеркивая биологический смысл уничтожения старых клеток. Отсутствие белка, кодируемого геном ygll29c, предотвращало апоптоз, вызванный YCA1 . Этот белок является аналогом митохондриального белка животных, DAP-3 , участвующего в цитокинзависимом апоптозе [ Skulachev, ea 2002 ].
Для осуществления апоптоза у дрожжей необходимо наличие функциональных митохондрий [ Manon, ea 1997 , Xu, ea 1998 ]. Инактивация теломер-связывающего белка Cdc 13 митохондриальным белком МТСОЗ вызывала у S. cerevisiae зависимый от каспаз апоптоз, что позволяет предполагать активное участие митохондрий дрожжей в апоптических процессах [ Qi, ea 2003 ]. Представители Bel-2 семейства у дрожжей не найдены; тем не менее гены проапоптозных белков млекопитающих при экспрессии в дрожжах вызывают их запрограммированную гибель. Так, например, экспрессия проапоптозного белка Вах под контролем промотора GAL10 приводила к индуцируемой галактозой гибели клеток S. cerevisiae [ Zha, ea 1996 ]. Таким образом, дрожжи представляют собой уникальную модель, позволяющую изучать на молекулярном уровне роль митохондрий в апоптозе [ Priault, ea 2003 ]. Именно с помощью дрожжевых моделей была показана необходимость С- концевого трансмембранного домена Вах для его цитотоксического действия [ Zha, ea 1996 ]. Они же позволили обнаружить в библиотеке ДНК млекопитающих новый супрессор Вах, блокирующий его встраивание в мембрану митохондрий - Ки70 [ Sawada, ea 2003 ].
Экспрессия Вах и Вак животных в клетках S. cerevisiae и Shizosacharomyces pombe приводила к гибели клеток с характерными для каждого случая внешними признаками [ Fraser and James, C.(1998) ]. У экспрессируюших Вах S. cerevisiae наблюдались конденсация хроматина вдоль ядерной оболочки, расщепление ДНК, образование мембранных везикул и перераспределение фосфатидилсерина. Одновременная экспрессия Вс1-2 или Bcl-xL , подавляющих апоптоз у животных, предотвращала вызванный Вах апоптоз у дрожжей [ Frohlich, ea 2000 ]. Кроме того, экспрессия Вс1-2 защищала S. cerevisiae от гибели, вызванной окислительным стрессом [ Chen, ea 2003 ].
Получен устойчивый к Вах мутант, у которого снижено количество белка Uthlp . Отсутствие этого белка не влияло на встраивание Вах во внешнюю мембрану митохондрий и высвобождение цитохрома с, но предотвращало окисление липидов митохондриальной мембраны и продукцию АФК . Отсутствие Uthlp вызывало также устойчивость к рапамицину - специфическому индуктору автолиза [ Camougrand, ea 2003 ].
У S.pombe найден 11ас19-белок (Sp Rad9) , содержащий последовательность аминокислот, необходимую для взаимодействия Sp Rad9 с Bcl-2 . Сверхэкспрессия Вс1-2 в клетках S. pombe повышала устойчивость лишенных Rad9 мутантов к УФ-излучению и ионизирующей рациации [ Komatsu, ea 2000 ].
Найден еще один гомолог Rad9, специфичный для почкующихся дрожжей [ Weinberger, ea 2003 ]. В геномах S. pombe и S. cerevisiae найдены гены белков-ингибиторов апоптоза ( IAP гены ) [ Uren, ea 1999 ]. Лишенный их мутант S. cerevisiae нормально рос и делился в полной среде. Однако при голодании его диплоидные клетки плохо формировали споры, образуя вместо этого псевдогифы. Большинство формирующихся спор не выдерживали более двух делений после прорастания. Споры такого же мутанта S. pombe погибали на ранних стадиях дробления после прорастания спор, поскольку останавливались на переходе между метафазой и анафазой из-за неспособности образовать нормальное митотическое веретено [ Uren, ea 1999 ]. Совсем недавно у S. cerevisiae найден белок, подобный HtrA-белку млекопитающих (у этих последних он является антагонистом XIAP [ Suzuki, ea 2001 ]). Этот белок назвали NmalIlp (nuclear mediator of apoptosis). Клетки, лишенные этого белка, лучше выживают при 50. и не обнаруживают признаков апоптоза при действии Н2О2. Сверхэкспрессия NmalIlp, напротив, вызывала апоптоз [ Fahrenkrog, ea 2004 ].
У дрожжей программированная смерть может быть вызвана веществами, которые они сами же и продуцируют, например, уксусной кислотой , продуктом брожения. 20-80 мМ - уксусная кислота вызывала у S. cerevisiae подавляемую циклогексимидом конденсацию хроматина вдоль ядерной оболочки, перераспределение фосфатидилсерина и обрыв нитей ДНК [ Ludovico, ea 2001 ].
Имели место также генерация АФК, выход цитохрома с в цитоплазму, снижение потребления кислорода и снижение величины дельта-пси-м [ Ludovico, ea 2002 ]. Гибель клеток, вызванная 120-200 мМ - кислотой, не подавлялась циклогексимидом и сопровождалась ультраструктурными изменениями, типичными для некроза [ Ludovico, ea 2001 ]. Аналогичным образом действовала уксусная кислота на клетки Candida ablicans [ Phillips ea 2003 ] и Zygosaccharomyces bailii [ Ludovico, ea 2003 ]. Причем у С. ablicans апоптоз вызывала 40-60 мМ - кислота, а у Z.bailii - 320-800 мМ; более высокие концентрации в каждом случае вызывали некроз.
а-Фактор , пептидный феромон, вырабатываемый а-типом гаплоидных клеток S. cerevisiae, при концентрации < 1 мкМ стимулировал конъюгацию клеток противоположного типа спаривания (а) с дрожжами А-типа, а при более высокой - вызывал блокаду клеточного цикла и апоптоз [ Severin, ea 2002 ]. Индуцированная феромоном смерть клеток сопровождалась типичными признаками апоптоза. Мутация активируемой им протеинкиназы предотвращала и смерть, и появление маркеров апоптоза [ Skulachev, ea 2002 ].
Цитохром с дрожжей , однако, не активировал каспазы в цитозольных экстрактах амфибий и млекопитающих.
От всех рассмотренных выше одноклеточных организмов дрожжи отличаются наличием так называемого RIP-белка (receptor interacting protein) взаимодействующего с Fas и с внутриклеточным доменом TNFR1 млекопитающих. С-Концевая область RIP содержит так называемый домен смерти (death domain) , присутствующий во внутриклеточных доменах Fas и TNFR1 . Сверхэкспрессия RIP вызывала появление морфологических признаков апоптоза [ Stanger, ea 1995 ].
