Ацетилирование и деацетилирование гистонов
Дополнительные экспериментальные подходы продолжали поставлять данные о том, что ацетилирование (versus отсутствие ацетилирования) коррелирует с транскрипцией. Районы, транскрипционно активные или готовые к транскрипции, склонны иметь "открытую" конфигурацию хроматина и поэтому доступны для таких ферментов, как ДНКаза и MN-ase, которые при добавлении к изолированным, но интактным ядрам могут переваривать ДНК. В начале 1990-х годов исследователи начали использовать иммунопреципитацию хроматина ( ChIP , chromatin immunoprecipitation) - мощный метод для анализа того, какие белки связываются с определенными нуклеотидными последовательностями ДНК in vivo. Этот метод включает создание поперечных сшивок в белках, связанных с ДНК, с помощью таких проникающих в клетку химических реагентов, как формальдегид, и последующую обработку ультразвуком для разрушения комплексов ДНК:белок до более мелких фрагментов. Интересующие исследователя комплексы ДНК:белок затем подвергаются иммунопреципитации с использованием специфических антител в качестве зонда. Затем поперечные сшивки ликвидируются, чтобы изолировать и идентифицировать нуклеотидные последовательности ДНК, ассоциированные с белком, который связался с антителом; при этом для анализа используется либо радиоактивно меченые ДНК-зонды, либо ПЦР . Одна группа использовала этот метод, чтобы исследовать корреляцию между сайтами в ДНК вокруг активных глобиновых генов, которые гиперчувствительны к перевариванию ДНКазой и ассоциируются с ацетилированными гистонами в эритроцитах курицы; корреляция оказалась очень тесной ( Hebbes et al., 1994 ). У S. cerevisiae аналогичные подходы были применены в транскрипционно "молчащих" районах генома, и были показаны очень низкие уровни ацетилирования гистонов ( Braunstein et al., 1993 ). Наоборот, генетическое нарушение сайленсинга коррелировало с увеличенным ацетилированием.
Все эти эксперименты постепенно обнаруживали, что гистоны и, в частности, сайты обратимого ацетилирования играют роль в регуляции генов. Однако первые ферменты ацетилирования и деацетилирования ядерных гистонов не были идентифицированы вплоть до середины 1990-х годов, и они явились наиболее прямым доказательством того, что эти ферменты играют роль в ходе транскрипции. Первая ядерная ацетилтрансфераза гистонов ( HAT ) была выделена из так называемого макронуклеуса (очень крупного транскрипционно активного ядра в отличие от мейотического микронуклеуса) инфузории Tetrahymena , который характеризуется высокими скоростями транскрипции ( Brownell et al., 1996 ). Ключевым подходом для выявления активности HAT оказался анализ "в геле" ("in-gel"): сложная смесь белков из клеточных экстрактов была разделена на пропитанном гистонами SDS-геле, затем пептиды были подвергнуты ренатурации, и белки с активностью фермента HAT метили этот гель путем переноса радиактивно меченного кофактора, ацетилкоэнзима A, на локализованные гистоны. Это делало возможным последующее биохимическое фракционирование и очистку этого полипептида. Идентифицированный энзим HAT был гомологичен ранее изолированному у S. cerevisiae коактиватору, называемому Gcn5 , о котором было известно, что он взаимодействует с транскрипционными активаторами. Одновременно первая деацетилаза гистонов ( HDAC ) была выделена посредством биохимической очистки ( Taunton et al., 1996 ). В этом случае фермент был очищен из клеточных экстрактов с помощью ингибитора, связанного с нерастворимым матриксом, который физически связывался с каталитическим сайтом фермента. Энзим оказался гомологичным ранее выделенному гену, игравшему роль кофактора в репрессии генов. Эти замечательные параллельные открытия первых ферментов, которые, как оказалось, метаболизируют ацетильные группы на гистонах, привели к модели, которая в настоящее время стала парадигмой для ген-специфичных гистоновых PTMs : связанные с ДНК активаторы рекрутируют HATs для того, чтобы ацетилировать нуклеосомные гистоны, тогда как репрессоры рекрутируют HDACs для того, чтобы деацетилировать гистоны. Эти изменения ведут к изменениям нуклеосомы и, соответственно, к ап- или даун- регуляции гена ( рис. 10.2 ).
Было показано, что многие другие хорошо известные коактиваторы и корепрессоры обладают активностью HAT или HDAC или ассоциируются с такими энзимами ( Sterner and Berger, 2000 ; Roth et al., 2001 ). Более того, ферментативные активности HATs и HDACs являются критическими для их роли в активации и репрессии генов. Эти энзимы часто являются компонентами крупных комплексов, модулярных по структуре и функции; модифицирующая гистоны ферментативная активность - это только одна функция, и в числе других, например, рекрутирование связывающегося с TATA белка ( ТВР , TATA-binding protein) ( Grant et al., 1998 ). Интересно, что некоторые ядерные рецепторы гормонов функционируют и как связывающиеся с ДНК репрессоры транскрипции (когда они не связаны с гормонами-лигандами), и как активаторы транскрипции (когда связаны с гормонами-лигандами); эти рецепторы осуществляют эти функции отчасти через посредство РТМ хроматиновых участков-мишеней, рекрутируя HDACs , когда они не связаны с лигандами, и HATs , когда связаны ( Baek and Rosenfeld, 2004 ).
Белки HAT могут ацетилировать остатки лизина на всех четырех коровых гистонах, но разные энзимы обладают разной специфичностью в отношении предпочтительного субстрата ( рис. 10.3 ; табл. 10.1 ), хотя каждый энзим редко "нацелен" только на один сайт. Одно главное семейство HAT - GNAT (сокращение для Gcn5 related acetyltransferase) "нацелено" на гистон НЗ как на свой основной субстрат. Второе главное семейство ацетилтрансфераз, семейство MYST , в качестве своего основного субстрата"нацелено" на гистон Н4 . Третье главное семейство - СВР/р300 - "нацелено" и на НЗ, и на Н4 и является самым неразборчивым. Был выполнен структурный анализ для каталитических доменов первых двух главных семейств (GNAT и MYST), и они оказались различающимися; структура семейства СВР/рЗОО пока еще не раскрыта. Между прочим, каждое из этих семейств ацетилтрансфераз способно также ацетилировать негистоновые субстраты ( Glozak et al., 2005 ).
Как обсуждалось выше (см. " Гистоны и ацетилирование играют регуляторную роль в транскрипции "), существуют три модели, описывающие роль HPTMs в регулирование структуры хроматина ( рис. 10.1 ). Первая модель рассматривает структурные изменения в хроматине, индуцируемые прямыми влияниями HPTMs , такие как изменения заряда. В этом случае нейтрализация ацетилированием положительно заряженного лизина уменьшает силу связывания сильно основных гистонов или гистоновых "хвостов" с отрицательно заряженной ДНК и таким образом открывает сайты связывания с ДНК ( Vettese-Dadey et al., 1996 ). Имеются также данные, все еще в пользу первой модели, что ацетилирование может декомпактизировать нуклеосомные порядки, что согласуется с ролью в открывании хроматина для активации генов ( Shorgen-Knaak et al., 2006 ). Третья модель предполагает, что HPTMs обеспечивают поверхность связывания, чтобы белки ассоциировались с хроматином и регулировали ДНК-матричные процессы; впервые это было показано для ацетилирования. Специализированный белковый домен, названный бромодоменом и обычно обнаруживаемый в ассоциированных с хроматином белках, специфически связывается с ацетилированными лизинами ( рис. 10.3 ) ( Dhalluinet al., 1999 ). Бромодомены присутствуют во многих HATs, таких как Gcn5 и СВР/рЗОО . Белки с этим мотивом, когда они являются частью крупных комплексов, ассоциированных с хроматином или изменяющих его, - например, таких как зависимый от АТФ ремоделирующий комплекс, Swi/ Snf - стимулируют его связывание с хроматином ( Hassan et al., 2002 ). Другими примерами белков, которые содержат бромодомены, обладающие специфичностью связывания с ацетилированными гистонами, являются Taf1 и Bdf1 в комплексе TFIID , Rsc4 в ремоделирующем комплексе Rsc и Brd2 в большом семействе бромодоменных белков.
Существуют многочисленные ферменты HDAC, удаляющие ацетильные группы ( Kurdistani and Grunstein, 2003 ; Yang and Seto, 2003 ). Они распадаются на три каталитические труппы, консервативные в эволюции от S. cerevisiae до млекопитающих, которые обозначаются как энзимы типа I , типа II и типа III, или родственные Sir2 . Ферменты типа I и типа II обладают близким механизмом деацетилирования, который не связан с кофактором, тогда как ферменты, родственные Sir2, требуют кофактор NAD в качестве компонента их каталитического механизма. Структура представителей всех этих трех семейств выяснена. Многие HDACs обнаруживаются в крупных мультисубъединичных комплексах, компоненты которых служат для "нацеливания" этих энзимов на гены, что ведет к репрессии транскрипции. Например, Rpd3 является частью крупного комплекса, включающего HDAC Sin3 , которая взаимодействует с репрессорами, связанными с ДНК ( Kurdistani and Grunstein, 2003 ; Yang and Seto, 2003 ). Rpd3 является также частью малого комплекса, "нацеленного" на открытые "рамки считывания" генов (ORFs) через ассоциацию хромодомена с НЗКЗ6mе (дальнейшее обсуждение хромодоменов см. в разделе " Метилирование гистонов "). Результатом этого оказывается деацетилирование гистонов, частично подавляющее инициацию внутренней РНК-полимеразы II (pol II), а также регулирующее различные этапы цикла транскрипции ( Carrozza et al., 2005 ; Joshi and Struhl, 2005 ).
