5'-нуклеотидаза (HT)

EC 3.1.3.5  

Gene: [00.0/NT5CP] cytosolic purine 5'-nucleotidase

Катализируемая реакция: 5'-рибонуклеотид + H2O = рибонуклеозид + Pi

Рекомендуемое название - 5'-нуклеотидаза.

Другие названия: аденозин-5'-фосфатаза, уридин-5'-нуклеотидаза, AMP- фосфатаза, аденозинмонофосфатаза, 5'-мононуклеотидаза, AMP-аза, UMP-аза, тимидинмонофосфатнуклеотидаза, 5'-AMP-аза, AMP-фосфогидролаза, аденозин- 5'-монофосфатаза, 5'-AMP-нуклеотидаза, IMP-5'-нуклеотидаза. Систематическое название - 5'-рибонуклеотидфосфогидролаза.

5'-Нуклеотидаза катализирует гидролитическое отщепление фосфата в положении 5 пентозы нуклеотидов. Хотя этот фермент распространен во всех тканях, повышение его активности обычно наблюдается при болезнях печени и желчных путей .5'-нуклеотидаза в клетках включает группу родственных ферментов, катализирующих дефосфорилирование нуклеозидфосфатов и дезоксинуклеозидфосфатов и отличающихся по субстратной специфичности, молекулярной массе, локализации, кинетическим и регуляторным свойствам. Различают связанную с мембранами и цитозольные формы HT.

Связанная с внешней стороной плазматических мембран НТ (эктоэнзим) используется как маркер ферментов, связанных с внешней поверхностью мембран клеток [ De Pieree J.W.,1974 ; Evans W.H.,1980 ].

Фермент связан с поверхностью мембраны гликозилфосфатидилинозитным остатком, присоединенным посттранскрипционно к Ser-523 аминокислотной последовательности [ Misumi Y.,1990a, Misumi Y.,1990b ]. Связанная с мембранами НТ выделена из многих тканей различных организмов. Она гидролизует нуклеозидфосфаты и дезоксинуклеозидфосфаты исключительно как 5'-монофосфаты, не проявляя активности (или очень малую) с 2'- или 3'-монофосфатами. Фермент обладает активностью FAD-пирофосфатазы ( EC 3.6.1.18 ) [ Lee R.S.F.,1988 ].

Основываясь на величинах Vmax/Km лучшим субстратом связанной с мембранами НТ является AMP . Например, соотношение активностей фермента из гепатоцитов крысы при использовании субстратов AMP:YMP:CMP:CMP:IMP равно 100:81:63:63:59 [ Chatterjee S.K.,1979 ]. Гидролиз AMP стереоселективен: L-энантимер AMP фермент не гидролизует [ Cusack N.J.,1983 ]. Величины Кm для AMP 10-50 мkМ, IMP 10-50мkМ. ATP, ADP и аденозин-5'-(альфа,вета-метилен)-дифосфат являются конкурентными ингибиторами фермента ; конвалин A-неконкурентный ингибитор, Pi слабо ингибирует фермент [ Zimmermann H.,1992 ]. Метилксантины (теофиллин и каффеин) - ингибиторы фермента [ Fredholm B.B.,1978 ].

Фермент состоит из идентичных субъединиц с молекулярной массой 60-80 кДа в зависимости от источника и является в нативном состоянии димером с молекулярной массой 120-160 кДа [ Zimmermann H.,1992 ]. Как щелочная фосфатаза (EC 3.1.3.1), ацетилхолинэстераза (КФ3.1.1.17) и аминопептидаза Р (КФ3.4.11.2), фермент содержит гликозилфосфатидилинозитный якорь [ Misumi Y.,1990a , Misumi Y.,1990 b].

Активность фермента полностью зависит от присутствия Mg*+ . Эта форма НТ содеpжит структурированный атом Zn*+ ; для фермента из печени цыпленка содержание Zn*+ составляет 2 г/атома на димерную молекулу белка [ Fini C.,1990 ].

5'-нуклеотидаза под действием фосфолипаз может освобождаться из мембран в цитозоль [ Grondal E.J.N.,1987 ].

В цитозольной фракции обнаружены две основные формы 5'- нуклеотидазы: с"высокой" и "низкой" величинами Кm. Цитозольные формы с "высокой" величиной Кm, гидролизующие предпочтительно IМР и AMP регулируются, очевидно, по аллостерическому принципу ATP и ADP [ Yamazaki Y.,1991 ; Spychala J.,1988 ]. Цитозольный фермент с "низкой" величиной Кm представляет собой, очевидно, освобожденную из мембраны экто-5'-нуклеотидазу [ Zimmermann H.,1992 ]. Активность этой формы фермента, также как и эктоэнзима ингибируется ATP [ Spychala J.,1988 ].

Активность дезоксинуклеотидазы из планцеты человека регулируется, очевидно, путем смещения равновесия между активным димером и неактивным (или малоактивным) мономером [ Fritzson P.,1991 ].

Цитозольные формы НТ. В настоящее время выделяют две основные формы фнрмента: с "высокой" и "низкой" величиной Кm.

НТ с "высокой" величиной Кm имеет две формы, отличающиеся по субстратной специфичности: фермент, катализирующий гидролиз преимущественно AMP и фермент, катализирующий гидролиз преимущественно IMP. Эти две формы фермента включены в метаболический контроль AMP и IMP. Могут также катализировать гидролиз дезоксирибонуклеозидмонофосфатов, но не 2'- или 3'- нуклеозидмонофосфатов.

Форма НТ, катализирующая гидролиз IMP. Молекулярная масса субъединицы 52-70 кДа, нативного фермента 200-265 кДа. Из планценты человека молекулярная масса субъединицы 53 кДа; нативный фермент является тетрамером с молекулярной массой 210 кДа [ Spychala J.,1988 ]. Активность фермента зависит от присутствия Mg2+; в плаценте человека Mg2+ -регулятор ферментативной активности [ Spychala J.,1988 ]. Эта форма наиболее активна с IMP и GMP и их дезоксипроизводными, значительно слабее активна с AMP. Величины Кm для IMP 0,1-0,6 мМ, для AMP 1-15 мМ. Милимолярные концентрации ATP и ADP увеличивали Vmax и сродство к IMP и AMP. Форма НТ ингибируется Pi, инозином и 2,3'-дидезоксиаденозином, образующимся в реакции обмена фосфатного остатка между IMP и нуклеозидом [ Keller P.M.,1985 ; Tozzi M.G.,1991 ]. 2,3-дифосфоглицерат [ Tozzi M.G.,1991 ; Itoh R.,1990] и диаденозинполифосфаты Ap3A, Ap4A, Ap5A [ Zimmermann H.,1992 ] стимуляторы активности фермента.

Цитозольная форма фермента, катализирующая преимущественно AMP. Молекулярная масса 40 кДа, нативный фермент является тетрамером с молекулярной массо 150 кДа [ Yamazaki Y.,1991 ]. Свойства этой формы НТ подобны свойствам цитозольной НТ, катализирующей преимущественно гидролиз IMP, однако эта форма НТ активируется только ADP, который сдвигает величину Кm в микромолярную область [ Yamazaki Y.,1991 ].

Предполагается, что обе цитозольные формы НТ с "высокой" КМ содержат аллостерический центр для ATP или ADP. Форма НТ, катализирующая преимущественно IMP широко распространена в тканях, тогда как форма НТ, катализирующая преимущественно AMP обнаружена только в сердце млекопитающих [ Zimmermann H.,1992 ].

Цитозольная форма НТ с "низкой" величиной КМ по своим свойствам идентична солюбилизированной фрме НТ, связанной с мембранами. Обе они имеют иднтичную молекулярную массу НТ с " низкой" КМ катализирует гидролиз AMP и пиримидиновых нуклеотидов [ Madrid-Marina V.,1986 ]. Эта форма НТ ингибируется ATP, ADP, аденозин-5'-(альфа, вета-метилен)- дифосфатом, конкавалином А [ Zimmermann H.,1992 ], производными ксантина [ Fredholm B.B.,1983 ]. Она содержит прочно связанный атом Zn [ Fini C.,1990 ]. Антитела, полученные к эктоэнзиму, также осаждали цитозольную форму НТ с "низкой" величиной КМ [ Zekri M.,1988 ]. Из плаценты человека цитозольная форма НТ с "низкой" величиной КМ содержала тоже количество мио-инизита, что и мембранный якорь белка [ Klemens M.R.,1990 ].

Вклад активности цитозольной формы НТ с "низкой" КМ в общую активность НТ в мозге быка и крысы оценен около 30% [ Lai K.M.,1991 ], количество этой формы сильно увеличивалось постмертно в мозге быка в течение времени [ Vogel M.,1992 ].

Существование множественности форм НТ может быть обусловлено негомогенными препаратами, условиями солюбилизации, очистки и определения активности [ Montero M.J.,1982 ; Kaminska Betry J.,1986 ; Zekri,1988 ]. Связанная с мембранами НТ из плаценты человека является сиалогликопротеином [ Harb J.,1988 ] и может быть разделена на множество (около 13) изоформ с pI 5,8-7,0 [ Buschette-Brambrink S.,1989 ].

Структурный ген человека НТ NT5 картирован для эктоэнзима. Его местоположение определено - 6q14-q21]. Структурный ген NT5 клонирован и секвенирован из микросом печени крысы [ Misumi Y.,1990a ] и плаценты человека [ Misumi Y.,1990b ]. Фермент синтезировался в печени крысы и плаценте человека как полипептид, содержащий 576 и 574 аминокислотных остатка, соответственно, с молекулярной массой около 64 кДа, затем посттрансляционно превращался превращался в промежуточную форму, содержащую 548 аминокислотных остатка для обоих источников с молекулярной массой около 61 кДа и содержащую гидрофобную область по C-концевой части полипептида. Эта промежуточная форма НТ окончательно превращалась в созревшую форму (523 аминокислотных остатка) путем протеолитического удаления якоря НТ и связанный с Ser-523.

Молекулярная масса созревшей НТ 73 и 71 кДа из печени крысы и плаценты человека соответственно [ Misumi Y.,1990b ]. Фермент из плаценты человека содержал 4, а из печени крысы пять потенциальных центров для N-гликозиллирования НТ [ Misumi Y.,1990a , Misumi Y.,1990 b ]. НТ из обоих источников содержала 90% идентичных аминокислот.

Гликозилирование-процессинг карбогидратной боковой цепи НТ изучен в клетках гепатомы [ Van den Bosch R.,1986 ], гепатоцитах [ Barin M.D.,1987 ] и бесклеточных системах [ Misumi Y.,1990a ; Wada I.,1986 ]. Ингибирование процесса N-гликозилирования НТ химическим агентами приводило к образованию фермента с молекулярной массой 57-59 кДа .

Экспрессия гена NT5 описана в нервной ткани [ Nacimiento W.,1990 ], в процессе постнатального созревания мозг а млекопитающих [ Bailyes E.M.,1990 ]. Экспрессия гена может регулироваться в моноцитах ретиноевой кислотой и интерфероном гамма [ Murray J.L.,1988 ], интерлейкином-1 бета и опухолевым фактором альфа в процессе цитокинез а [ Stefanovic V.,1989 ] и простагландином Е2. 5'-нуклеотидаза(3.1.3.5)

Ссылки:

Все ссылки