Влияние внеклеточного матрикса и ростовых факторов на клетку
Наиболее значимыми элементами микроокружения, способными влиять на дифференцировку гепатоцитов и поддержание эпителиальной морфологии, представляются ВКМ (внеклеточный матрикс) и ростовые факторы [ Abelev, 2006 ]. За последние годы появляется все больше свидетельств того, что эти факторы в значительной мере контролируют активность регуляторной сети гепатоцитарных ядерных факторов (ГЯФ) в нормальных и опухолевых клетках.
Разрушение архитектуры печени при получении первичных культур гепатоцитов, сопровождающееся нарушением межклеточных взаимодействий и взаимодействия клеток с матриксом, вызывает массированные изменения в транскрипционной программе клеток. Даже в присутствии необходимых для этого типа клеток ростовых факторов, в первичных гепатоцитах происходит утрата полярности и изменение морфологии клеток, а также быстрое подавление экспрессии многих тканеспецифических генов. Эту дедифференцировку по крайней мере частично можно преодолеть при культивировании гепатоцитов в трехмерном матриксе, продуцируемом клетками мышиной саркомы Engelbreth-Holm-Swarm ( EHS ) [ Ben-Ze'ev, 1988 ], в состав которого входят ламинин , коллаген IV типа , гепарансульфатпротеогликан , энтактин и некоторые факторы роста. При обратимой дедифференцировке в культуре снижаются уровни транскрипции ключевых факторов, определяющих транскрипционную программу зрелых гепатоцитов - С/ЕВРaльфа , HNF4aльфа и его непосредственной мишени HNF1aльфа , в то время как культивирование в EHS-матриксе вызывает восстановление транскрипции HNF4aльфа , HNF1aльфа и усиление ДНК- связывающей активности С/ЕВРaльфа [ Oda, 1995 , Runge, 1997 , Kimata, 2006a ].
Таким образом, можно предположить, что факторы HNF4aльфа и С/ЕВРальфа опосредуют матрикс-зависимую редифференцировку первичных гепатоцитов.
Вероятно, С/ЕВРaльфа не является ключевым звеном в этом процессе, поскольку отсутствие этого фактора не влияет на зависимую от внеклеточного матрикса (ВКМ) активацию гена альбумина в первичных гепатоцитах, полученных от С/ЕВРaльфа-/- мышей [ Soriano, 1998 ]. В то же время инактивация HNF4aльфа в первичных гепатоцитах крысы с помощью коротких интерферирующих РНК отменяет индуцируемую EHS активацию экспрессии маркеров гепатоцитарной дифференцировки, но не влияет на состояние актинового цитоскелета [ Kimata, 2006a ]. Аденовирус-опосредованная экзогенная экспрессия HNF4aльфа в этих клетках способствует долговременному сохранению морфологической и функциональной дифференцировки гепатоцитов [ Naiki, 2005 ].
Ранние этапы спецификации печени и индукция экспрессии гепатоспецифических генов определяются активностью факторов семейства FoxA [ Lemaigre, 2004 ]. На некоторых модельных системах описана зависимость активности белков этого семейства и транскрипции гена альбумина от ВКМ [ di Persio, 1991 ]. Однако в первичных гепатоцитах экспрессия FoxA1 при дедифференцировке повышается, а культивирование в EHS -геле сопровождается снижением ДНК- связывающей активности FoxA [ Oda, 1995 , Runge, 1998 ]. Таким образом, маловероятно, что индукция дифференцировочной программы гепатоцитов в этой системе связана с активностью факторов семейства FoxA . Это согласуется с тем, что значимость факторов FoxA в контроле дифференцировки зрелых гепатоцитов значительно снижается по сравнению с ранними этапами эмбриогенеза [ Sund, 2000 ].
Сходные закономерности описаны на еще одной экспериментальной модели, в которой "мелкие гепатоциты" (по-видимому, овальные клетки печени или их производные) под действием ВКМ претерпевают дифференцировку, сопровождающуюся приобретением характерных морфологических особенностей зрелых гепатоцитов и индукцией транскрипции функциональных генов [ Sugimoto, 2002 ]. Эти изменения сопровождаются активацией HNF4aльфа , HNF6 , C/EBPaльфа и С/ЕВРбета . Важно отметить, что ни ростовые факторы, ни компоненты матрикса, входящие в состав EHS -геля, не способны по отдельности индуцировать описанную морфологическую и функциональную дифференцировку.
Анализ профилей экспрессии генов в гепатоцитах, культивируемых в EHS-геле или без него, позволил выявить значительную индукцию экспрессии фосфатидилинозитол-4,5-бифосфат(Р1[4,5]Р2)-фосфатазы под действием внеклеточного матрикса (ВКМ). Это событие приводит к снижению уровня Р1(4,5)Р2, который влияет на организацию актина посредством изменения активности различных актинрегулирующих белков и активации полимеризации актина в ответ на внеклеточные стимулы. Деполимеризация актина, наблюдающаяся в EHS-геле, может быть ревертирована с помощью ингибиторов путем повышения уровня Р1(4,5)Р2 в клетке и сопровождается снижением экспрессии HNF4aльфа и маркеров гепатоцитарной дифференцировки [ Kimata, 2006b ].
В клеточной культуре энтероцитов Сасо-2 описана зависимость изменения внутриклеточного распределения и транскрипционной активности HNF4aльфа при усилении или ослаблении межклеточной адгезии, опосредованной Е-кадхерином [ Peignon, 2006 ].
Все эти данные указывают на HNF4aльфа как на центральное звено, определяющее зависимость транскрипционной программы нормальных гепатоцитарных клеток от элементов микроокружения - ВКМ, межклеточных контактов и факторов роста, продуцируемых другими типами клеток.
Цитокины и ростовые факторы, продуцируемые мезенхимальными клетками, с первых же этапов эмбрионального развития играют значительную роль в активации тканеспецифических дифференцировочных программ [ Lemaigre, 2004 ]. Эти факторы могут не только непосредственно регулировать уровни тех или других гепатоцитарных ядерных факторов (ГЯФ) в клетке, но и модулировать их действие в зависимости от положения клетки в общей архитектуре органа [ Clotman, 2005 ]. Дальнейшее развитие транскрипционной программы гепатоцитов, поддержание их функциональной и структурной дифференцировки и контроль пролиферации также опосредованы действием различных факторов, продуцируемых стромальными клетками. По мере развития злокачественного фенотипа опухолевые клетки приобретают способность самостоятельно секретировать ростовые факторы, которые не только активируют пролиферацию, но и обусловливают дополнительную независимость клеток от элементов микроокружения [ Gotzmann, 2002 ].
Ростовые факторы могут модулировать экспрессию ГЯФ кооперативно вместе с изменениями ВКМ. Так, экспрессия HNF4aльфа в культуре эмбриональных мышиных гепатоцитов может быть активирована при действии ВКМ и родственного интерлейкину-6 фактора онкостатина М [ Kamiya, 2003 ]. Этот дифференцировочный эффект может быть подавлен действием фактора некроза опухолей aльфа [ Kamiya, 2004 ].
