РНКi и сайленсинг генов, направляемый РНК
Сведения о том, что конститутивный гетерохроматин в центромерах и теломерах играет инструктивную роль в обеспечении целостности генома, способствовали сдвигу парадигмы во взглядах на повторяющуюся некодирующую "мусорную" ДНК. Возможно ли, что эти повторяющиеся последовательности служат каким-то "незряшным" целям, которые еще только начинают проясняться? Не может ли даже быть так, что эти нуклеотидные последовательности ДНК не являются полностью "молчащими"?
Такая возможность вытекает из фундаментальной серии открытий, связывающих РНКи с образованием "молчащего" хроматина (гетерохроматина). РНКи является защитным механизмом организма-хозяина, который разбивает dsRNA на мелкие молекулы РНК (известные как короткие интерферирующие РНК или siRNA ). Этот процесс в конечном счете приводит к деградации РНК или к использованию этих малых РНК для подавления трансляции, известного как посттранскрипционный сайленсинг (PTGS) . Открытый позже механизм транскрипционного сайленсинга генов (TGS) , ведущего к образованию гетерохроматина, был обнаружен в результате конвергенции независимых линий исследования хроматина и механизма РНК-интерференции. С одной стороны, многое известно о репрессивном метилировании ДНК (у грибов, растений и млекопитающих), модификациях хроматина (например, НЗК9meЗ ) и ассоциированных с хроматином факторах ( НР1 ), характерных для доменов гетерохроматина. С другой стороны, исследователи преуспели в идентификации факторов механизма РНКи (например, Dicer , Argonaute , РНК-зависимой РНК-полимеразы, или RdRP ). Наиболее убедительный прогресс, связавший вместе эти вроде бы разные области, был достигнут в элегантных исследованиях на S. pombe , в которых мутации любого компонента механизма РНКи приводили к дефектам в расхождении хромосом ( Hall et al., 2002 ; Reinhart and Bartel, 2002 ; Volpe et al., 2002 ). Это было вызвано неспособностью стабилизировать центромерный гетерохроматин и подчеркивало, по-видимому, широко распространенную роль механизмов, опосредованных РНКи, в образовании доменов "молчащего" гетерохроматина. Это также высветило значение гетерохроматина помимо транскрипционного сайленсинга генов - его роль в поддержании целостности генома и, отсюда, жизнеспособности, как показывает необходимость центромерного гетерохроматина для процесса расхождения хромосом. Появляющиеся данные позволяют также предполагать, что siRNAs требуются для определения других специализированных районов функционального гетерохроматина, таких как теломеры .
Транскрипция с обеих нитей ДНК прицентромерных районов у S. pombe и выявление прошедших процессинг дериватов siRNAs явились сильным доказательством того, что дериват dsRNA был важнейшим субстратом для "нацеливания" комплекса RITS на центромеры для сайленсинга ( рис. 3.14 ) ( Verdel et al., 2004 ). Более того, мутанты clr4 (имеющийся у S. pombe ортолог Suv39h НКМТ млекопитающих) были не способны процессировать dsRNA до siRNAs, усиливая тем самым доводы в пользу взаимосвязи между механизмом РНКи и сборкой гетерохроматина ( Motamedi et al., 2004 ). Каким именно образом siRNAs, генерируемые механизмом RNAi (т.е. Dicer , Argonaute , RdRP ), инициируют сборку гетерохроматина или направляют ее на соответствующие локусы в геноме, все еще неизвестно. Была предложена модель, в которой сложное взаимодействие между входящим в состав механизма RNAi комплексом RITS и центромерными повторами ведет к самоусиливающемуся циклу формирования гетерохроматина, включающему Clr4 , HDACs , Swi6 (ортолог НР1 млекопитающих) и когезин, вероятно через направляемый Ago отжиг гибридов РНК:РНК до образующегося транскрипта ( рис. 3.14 ) (главы " Грибы как модельные организмы для эпигенетических исследований " и " RNAi и сборка гетерохроматина ").
У Tetrahymena аналогичный механизм "нацеливания", опосредованного РНК, направляет уникальный процесс элиминации ДНК в соматическом ядре. В этом случае на соответствующей стадии полового процесса происходит, с обеих нитей, транскрипция внутреннего элиминируемого сегмента (IES - internal eliminated segment) в "молчащем" геноме зародышевого пути (микронуклеарном геноме) ( Chalker and Yao, 2001 ; Mochizuki et al., 2002 ). Аналогично модели TGS , зависимого от RNAi, была предложена модель сканирующей РНК (scnRNA) для объяснения того, как нуклеотидные последовательности ДНК в родительском макронуклеусе могут эпигенетически контролировать геномные изменения в новом макронуклеусе с участием малых РНК (детали см. в главе " Эпигенетика инфузорий "). Эти волнующие результаты впервые демонстрируют RNAi-подобный процесс, непосредственно изменяющим соматическии геном. Возникает любопытная возможность, что межгенные РНК, продуцируемые в локусе V-DJ ( Bolland et al., 2004 ), потенциально могут направлять элиминацию нуклеотидной последовательности ДНК в ходе V-DJ-рекомбинации локуса тяжелой цепи иммуноглобулина (IgH) в В-клетках и локусов Т-клеточного рецептора (TCR) в Т-клетках .
У растений имеется ряд ортологов для многих компонентов RNAi, обусловливающих разнообразие путей РНК-сайленсинга, которые могут действовать с большей специфичностью по отношению к конкретным нуклеотидным последовательностям ДНК, хотя имеет место некоторая избыточность между факторами. Исследования TGS , опосредованного RNAi, выявили новый класс РНК-полимераз - РНК-полимеразу IV (или RNA pol IV), - которые могут транскрибировать ДНК исключительно в гетерохроматиновых районах ( Неrr et al., 2005 ; Pontier et al., 2005 ). Опять-таки только для растений характерно, что пути RNAi непосредственно влияют на метилирование ДНК ( Chan et al., 2004 ).
RNAi-подобные хроматиновые эффекты были также обнаружены у Drosophila и млекопитающих. Например, обработка пермеабилизированных клеток млекопитающих РНКазой A быстро удаляет гетерохроматиновые метки НЗК9meЗ, что позволяет предполагать, что часть молекул РНК могут быть структурным компонентом околоцентромерного гетерохроматина ( Maison et al., 2002 ). У позвоночных удаление факторов, процессирующих siRNA, нарушает метилирование НЗК9 и связывание НР1 в перицентромерном гетерохроматине ( Fukugawa et al., 2004 ). Любопытно, что у мутантов, лишенных Dicer , эмбриональные стволовые (ES) клетки все еще пролиферируют, но не могут дифференцироваться ( Kanellopoulou et al., 2005 ), что заставляет предположить существование сегодня еще непонятной связи между механизмом RNAi и развитием млекопитающих. У Drosophila сайленсинг тандемных наборов гена mini-white , подверженных PEV , также оказывается зависимым от механизма RNAi ( Pal-Bhadra et al., 2004 ).
В совокупности эти исследования указывают на ключевую и, вероятно, первичную роль некодирующих РНК в переключении эпигенетических переходов и наследственно поддерживаемых специфических состояний хроматина хроматиновой матрицы . В самом деле, эти некодирующие РНК дали ответ на вопрос о том, как различные повторяющиеся последовательности у разных организмов достигают состояния гетерохроматинизации посредством механизма, "нацеливаемого" с помощью РНК. Стремясь идентифицировать новые мишени для RNAi, обнаружили, путем секвенирования малых РНК, что у растений, Drosophila, млекопитающих и других организмов они в основном транскрибируются с эндогенных транспозонов и других повторяющихся последовательностей ( Almeida and Allshire, 2005 ; Bernstein and Allis, 2005 ). В совокупности эти результаты показывают, что RNAi эволюировала, отчасти, в целях поддержания стабильности геномов посредством сайленсирующих мобильных элементов ДНК и вирусов и у большинства эукариотических видов представляет собою консервативный механизм. Сейчас, однако, оказывается, что не только РНК-сайленсинг репрессирует инвазивные последовательности, но что, кроме того, этот базовый механизм был использован клеткой для гетерохроматинизации центромер, обеспечивая тем самым корректное расхождение хромосом и целостность генома.
Все приведенные выше примеры показывают удивительное изменение центральной догмы контроля генов, формулировка которого начинает выглядеть следующим образом: ДНК -> некодирующие РНК -> хроматин -> функция гена. Никто не предвидел появление представлений о том, что некодирующие РНК активно участвуют в работе RNAi-подобных механизмов, которые также "нацеливают" локус-специфичные домены на ремоделинг хроматина и сайленсинг генов .
