Окрашивание по Граму: грамположительное и грамотрицательное

В зависимости от строения клеточной стенки прокариоты , относящиеся к эубактериям , делятся на две большие группы. Было обнаружено, что если фиксированные клетки эубактерий обработать сначала кристаллическим фиолетовым, а затем йодом, образуется окрашенный комплекс. При последующей обработке спиртом в зависимости от строения клеточной стенки судьба комплекса различна: у так называемых грамположительных видов этот комплекс удерживается клеткой, и последние остаются окрашенными, у грамотрицательных видов, наоборот, окрашенный комплекс вымывается из клеток, и они обесцвечиваются. (Этот способ был впервые предложен в 1884 г. датским ученым Х.Грамом (Ch.Gram), занимавшимся окрашиванием тканей. Позднее он был использован для бактерий).

У некоторых эубактерий положительная реакция при окрашивании описанным выше способом свойственна только клеткам, находящимся в стадии активного роста. Выяснено, что окрашенный комплекс образуется на протопласте , но его удерживание клеткой или вымывание из нее при последующей обработке спиртом определяются особенностями строения клеточной стенки.

Окрашивание препаратов увеличивает чувствительность микроскопии, так как неокрашенные бактерии плохо различимы даже при увеличении в 400-1000.

Наиболее распространена дифференциальная окраска по Граму, хотя применяют и монохромные окраски. Окраска по Граму позволяет отличить бактерии , чья толстая клеточная стенка практически полностью состоит из пептидогликана ( грамположительные ), от бактерий, чья клеточная стенка помимо тонкого слоя пептидогликана имеет наружную мембрану, состоящую из липопротеидов и липополисахаридов ( грамотрицательных ). Основный краситель (например, кристаллический фиолетовый) прочно фиксируется в стенке грамположительных бактерий, придавая им иссиня-черный цвет, и легко вымывается спиртом (или ацетоном) из стенки грамотрицательных бактерий, после чего они докрашиваются контрастным красителем (например, сафранином) в красный цвет.

Окраска по Граму незаменима при исследовании мазков мокроты. Если мокрота получена правильно, в ней обнаруживают не менее 25 нейтрофилов и менее 10 эпителиальных клеток в поле зрения при малом увеличении. Большее количество эпителиальных клеток и разнообразие типов бактерий свидетельствуют о том, что мокрота загрязнена содержимым ротоглотки. Хотя отличить нормальную микрофлору от патогенных бактерий нередко бывает трудно, окраска мазка по Граму дает ценную информацию, если патогенная бактерия имеет какой-либо доступный определению признак ( биологический сигнал ). Например, при бактериальном вагинозе в мазке из влагалища видны эпителиальные клетки, усеянные грамположительными бактериями.

Микроскопию мазков кала, окрашенных по Граму, используют как отборочное исследование. При обнаружении нейтрофилов приступают к бактериологическому исследованию и определению токсинов, вырабатываемых Clostridium difficile .

Окраску по Граму используют также для выявления бактерий и лейкоцитов в СМЖ, синовиальной, плевральной и перитонеальной жидкости. Нижний предел чувствительности метода составляет 10000 бактерий на 1 мл.

Чтобы увеличить чувствительность, исследуемую жидкость центрифугируют и готовят окрашенный мазок осадка. Эта процедура называется обогащением материала. Она проста и особенно ценна для выявления бактерий и лейкоцитов в СМЖ и кислотоустойчивых бактерий в мокроте.

Ссылки:

Все ссылки